改良QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中毒氟磷殘留

楊金川，白雪梅，戴奕杰，宋忠霞

1. 貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院（貴陽(yáng) 550001）；2. 貴州省廣告監(jiān)測(cè)中心（貴陽(yáng) 550001）

農(nóng)藥具有保護(hù)農(nóng)作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量的作用，但在使用農(nóng)藥的同時(shí)，其殘留同樣會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康產(chǎn)生一定的影響。2013—2019年，每年新登記的農(nóng)藥，年增長(zhǎng)率為5.61%[1]，但新農(nóng)藥的檢測(cè)技術(shù)卻又一定的滯后，而對(duì)這些新農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)安全檢測(cè)依舊需要，因此需要發(fā)展對(duì)應(yīng)的新檢測(cè)技術(shù)。毒氟磷（dufulin，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1），化學(xué)名稱(chēng)為N-[2-（4-甲基苯并噻唑基）]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基膦酸酯，是由貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心研究開(kāi)發(fā)的一種結(jié)構(gòu)新穎且具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型α-氨基膦酸酯類(lèi)高效抗病毒劑，對(duì)煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒具有較好的防治效果[2]，因此在煙草病毒病、番茄病毒病以及黃瓜病毒病的防治上得到了廣泛應(yīng)用。目前，關(guān)于毒氟磷的檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）[7]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8-12]等。盧平等[2]用體內(nèi)誘生制備克隆抗體檢測(cè)毒氟磷的ELISA方法，該方法制備克隆抗體耗時(shí)復(fù)雜，對(duì)類(lèi)似α-氨基膦酸酯類(lèi)化合物易引起交叉反應(yīng)。Zhu等[6]報(bào)道了用乙酸乙酯提取、濃縮，采用UPLC檢測(cè)土壤及番茄中毒氟磷的殘留，該方法前處理比較傳統(tǒng)，耗費(fèi)大量有機(jī)試劑，且定性能力弱，抗干擾能力差，容易引起假陽(yáng)性。丁立平等[7]采用正己烷-丙酮（V+V，1+1）提取，PSA、C18和GCB的混合固相萃取柱凈化后，GC-MS檢測(cè)黃瓜和番茄中毒氟磷的殘留，該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)，且GC-MS法為低分辨質(zhì)譜，當(dāng)樣品基質(zhì)復(fù)雜時(shí)，特別是質(zhì)荷比比較接近的目標(biāo)物和干擾物則不能有效地區(qū)分，同樣會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性而造成誤判。Li等[9]、鄭坤明等[12]分別采用QuEChERS前處理，LC-MS/MS檢測(cè)毒氟磷的殘留，該方法前處理簡(jiǎn)單，儀器檢測(cè)抗干擾能力強(qiáng)，但對(duì)檢測(cè)儀器要求較高，適用性會(huì)受到一定的限制。而研究則以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法檢測(cè)毒氟磷的殘留，GC-MS/MS不僅分離度好，抗基質(zhì)抗干擾能力強(qiáng)，而且還具有更高的靈敏度和專(zhuān)屬性。QuEChERS方法則因其前處理簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于動(dòng)植物性食品中農(nóng)獸藥殘留的前處理分析。因此，研究以4種蔬菜（番茄、韭菜、黃瓜、小白菜）中殘留的毒氟磷為對(duì)象，建立了一套QuEChERS-GC-MS/MS的分析方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)毒氟磷的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)，以期為蔬菜中毒氟磷的殘留檢測(cè)提供參考。

圖1 毒氟磷結(jié)構(gòu)式

1 試驗(yàn)部分

1.1 藥劑、試劑及主要儀器

毒氟磷（dufulin）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，粒徑為40～63 μm）；十八烷基鍵合硅膠（C18，粒徑為40 μm）；石墨化炭黑（GCB）；石墨化炭黑-氨基復(fù)合固相萃取柱（Carb/NH2，500 mg/500 mg，6 mL；島津科技有限公司）；乙酸乙酯為色譜純，乙腈、甲苯、無(wú)水硫酸鎂及氯化鈉為分析純。

氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（TRACE 1310-TSQ 8000，美國(guó)Thermo Scientific公司），配電子轟擊離子源（EI）；ME1002/02分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

移取500 μL質(zhì)量濃度為100 mg/L毒氟磷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋定容，配制成濃度為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃貯存，備用。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 樣品的制備

取1 kg可食性部分蔬菜（番茄、韭菜、黃瓜、小白菜）樣品，將其樣品切碎后混勻，通過(guò)四分法把樣品轉(zhuǎn)入到組織搗碎機(jī)中搗碎成勻漿密封后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品的前處理

分別比較了QuEChERS前處理和SPE前處理。

QuEChERS前處理：稱(chēng)取10 g（精確至0.01 g）勻漿樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈勻漿提取2 min，再加入4～5 g NaCl均質(zhì)1 min，然后以5 000 r/min離心5 min；取6 mL上清液于15 mL預(yù)裝有900 mg MgSO4、100 mg PSA、50 mg C18及30 mg GCB的聚丙烯QuEChERS凈化管中，渦旋振蕩1 min，以6 000 r/min離心5 min，然后取2 mL上清液于玻璃試管中，于45 ℃水浴，氮吹至近干，用1 mL乙酸乙酯定容后，渦旋混合復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，待GC-MS/MS檢測(cè)。

SPE前處理：稱(chēng)取10 g試樣（精確至0.01 g）勻漿樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，勻漿提取2 min，再加入4～5 g NaCl均質(zhì)1 min，然后以5 000 r/min離心5 min，取上清液8 mL于15 mL玻璃試管中，45 ℃水浴，氮吹至近干，用1 mL丙酮-正己烷（V∶V，1∶2）混合溶液復(fù)溶，待凈化；凈化參考丁立平等[7]前處理過(guò)程，用5 mL丙酮-正己烷（V∶V，1∶1）活化Carb/NH2柱，棄去預(yù)洗液，將上述樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至Carb/NH2柱中，用4 mL丙酮-正己烷（V∶V，1∶2）分兩次洗滌樣液試管，并將洗液移入柱中，再用10 mL丙酮-正己烷（V∶V，1∶1）淋洗，收集淋洗液于15 mL玻璃試管中，于45 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用2 mL乙酸乙酯定容后，渦旋混合復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，待GC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 分析方法

1.4.1 氣相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：石英毛細(xì)管柱TG-5 MS，30 m×0.25 mm× 0.25 μm；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.00 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。程序升溫：初始溫度為100 ℃，保持1 min；然后以20 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；共記24 min。

1.4.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件

EI離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：氬氣，純度≥99.999%；選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描（selective reaction monitoring，SRM）模式。

上述條件下，毒氟磷的保留時(shí)間、定性及定量離子等信息見(jiàn)表1。

表1 毒氟磷的CAS號(hào)，分子量及GC-MS/MS測(cè)定的保留時(shí)間、定性和定量離子以及碰撞能量

1.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是由于目標(biāo)化合物和基質(zhì)成分在離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而影響目標(biāo)化合物信號(hào)的增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象。按式（1）計(jì)算樣品的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)-20%＜ME＜20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)-50%＜ME≤ -20%或20%≤ME＜50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤ -50%或≥50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[13]。

式中：B為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值；A為樣品基質(zhì)中添加相同含量農(nóng)藥的響應(yīng)值。

用對(duì)應(yīng)基質(zhì)空白溶液對(duì)5 mg/L儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)涑少|(zhì)量濃度為5，10，50，100，200和1 000 μg/L的一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.4節(jié)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

在氣相色譜系統(tǒng)中，目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離多采用程序升溫方式，韭菜基質(zhì)相比其他3種基質(zhì)更為復(fù)雜，所以本文以韭菜基質(zhì)為研究對(duì)象，選用TG-5MS色譜柱檢測(cè)，通過(guò)摸索，并就升溫速率、分離效果及碰撞能量反復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，得到優(yōu)化后的色譜參數(shù)，見(jiàn)1.4節(jié)。在所選定的儀器條件下，色譜圖（見(jiàn)圖2）。

圖2 韭菜中毒氟磷的GC-MS/MS總離子流和提取離子色譜圖

2.2 提取、凈化條件選擇

2.2.1 提取試劑的選擇

研究選用農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的正己烷、丙酮和乙腈3種提取試劑來(lái)考察前處理效率和回收率，結(jié)果表明：正己烷作為提取試劑提取過(guò)程無(wú)法浸入組織內(nèi)部，導(dǎo)致回收率不高；丙酮提取的雜質(zhì)較多，后續(xù)的分離凈化處理繁瑣；乙腈作為提取試劑，因其良好的共萃和分層特性，為后續(xù)的分離凈化提供方便，并且擁有良好的回收率。因此該研究選用乙腈作為提取試劑。

2.2.2 凈化條件選擇

QuEChERS凈化劑的選擇：蔬菜中含有豐富的糖類(lèi)、有機(jī)酸、纖維素、維生素和色素等，如何去除蔬菜基質(zhì)中的色素、糖類(lèi)、有機(jī)酸等雜質(zhì)是凈化的關(guān)鍵，而QuEChERS中用到的吸附劑填料主要有PSA、C18、GCB和MgSO4，其中PSA可以有效凈化樣品中的有機(jī)酸、糖類(lèi)和部分色素，C18可以有效凈化酯類(lèi)，GCB主要用于吸附色素，MgSO4則用于吸附有機(jī)提取液中的水分。為了更高效地去除樣品基質(zhì)中的各類(lèi)雜質(zhì)，QuEChERS固相分散凈化吸附劑則是使用其中的一種或多種吸附劑和MgSO4的混合物組成。以基質(zhì)最為復(fù)雜的韭菜為研究對(duì)象，通過(guò)兩步考察對(duì)基質(zhì)的凈化：色素和糖類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸等其他雜質(zhì)。對(duì)于色素的凈化，研究主要考察了4組GCB的含量，分別為10，20，30和50 mg，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)30 mg GCB就可以去除絕大部分的色素，所以研究結(jié)合30 mg GCB，后續(xù)考察了5種凈化組合，在添加濃度為0.05 mg/kg的韭菜樣品，以“1.3.2”節(jié)QuEChERS前處理，考察凈化回收效果，結(jié)果（圖3）：組合Ⅱ比組合Ⅰ回收率低，這是因?yàn)镃18可以有效凈化酯類(lèi)，但蔬菜中主要富含糖類(lèi)，有機(jī)酸，色素等，而脂肪含量很低，可能會(huì)引起C18對(duì)毒氟磷吸附；組合Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的回收率差異不大，但綜合PSA及C18的凈化效果，為了減少對(duì)儀器系統(tǒng)污染，最終選用GCB 30 mg+PSA 100 mg+C1850 mg+MgSO4900 mg組合Ⅲ，作為凈化吸附劑。

圖3 韭菜中毒氟磷在5種凈化劑中的回收率（0.05 mg/kg）

SPE凈化柱的選擇：Carb/NH2復(fù)合固相萃取柱能夠有效去除色素、有機(jī)酸及酚類(lèi)化合物，是農(nóng)藥殘留中常用的一種固相萃取小柱。在添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05 mg/kg韭菜樣品中（n=3），研究選擇用該凈化柱，通過(guò)“1.3.2”節(jié)SPE前處理，平均回收率為95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%，滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

通過(guò)對(duì)比QuEChERS前處理和SPE前處理發(fā)現(xiàn)：雖然Carb/NH2復(fù)合固相萃取柱的凈化效果更佳，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，需消耗大量試劑；而QuEChERS凈化管前處理，可在滿(mǎn)足凈化要求及回收率的同時(shí)，前處理效率更高，成本更低，可快速處理樣品。所以研究選用以乙腈為提取試劑，并選用預(yù)裝有900 mg MgSO4、100 mg PSA、50 mg C18及30 mg GCB的聚丙烯凈化管的QuEChERS前處理方法。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限與定量限

以質(zhì)量濃度50 μg/L的毒氟磷，采用1.5中基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)公式（1）進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果表明：毒氟磷在4種蔬菜基質(zhì)（番茄、韭菜、黃瓜、小白菜）中的ME分別為-22%，-61%，-27%和-43%，存在著中強(qiáng)性基質(zhì)抑制效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)是影響農(nóng)藥殘留檢測(cè)定量準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素，但空白基質(zhì)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液可以很好的消除基質(zhì)效應(yīng)[14]。因此，為了降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

按1.5節(jié)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，用GC-MS/MS檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：毒氟磷峰面積與對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系，在番茄、韭菜、黃瓜、小白菜中的決定系數(shù)R2分別為0.999 3，0.999 1，0.999 5和0.999 8。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算得基質(zhì)檢出限（SLOD）為0.001 5 mg/kg；以10倍信噪比（S/N）計(jì)算得基質(zhì)定量限（SLOQ）為0.005 mg/kg。

2.4 方法的精密度與回收率

當(dāng)空白樣品中添加水平分別為0.005，0.05，0.5和3 mg/kg，每個(gè)水平進(jìn)行5次重復(fù)時(shí)，毒氟磷在4種蔬菜中的平均回收率在89%～104%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）在2.4%～7.2%之間（表2）。表明該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

表2 毒氟磷在番茄、韭菜、黃瓜、小白菜中4個(gè)水平下的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了GC-MS/MS快速測(cè)定蔬菜樣品中毒氟磷殘留的分析方法，樣品用乙腈提取，QuEChERS凈化，濃縮后，經(jīng)TG-5 MS色譜柱分離，GC-MS/MS檢測(cè)，相比傳統(tǒng)前處理操作繁瑣耗時(shí)且需消耗大量有機(jī)溶劑，以及常規(guī)色譜抗干擾能力弱等問(wèn)題，該方法前處理簡(jiǎn)單，便于操作，定性準(zhǔn)確，重復(fù)性好且靈敏度高，能滿(mǎn)足4種蔬菜中毒氟磷的快速定性和定量檢測(cè)，也可為毒氟磷在其他果蔬樣品中的殘留檢測(cè)提供參考。