乙醇注入法制備肉桂醛脂質體的工藝優化

常大偉

閆 瑾1

雷 琦1

王虎玄1

王 歡2

(1. 陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2. 楊凌質量技術檢測檢驗所，陜西 楊凌 712100)

肉桂醛是一種從肉桂中提取的黃色黏性液體，是肉桂精油的主要成分，具有抑菌、抗氧化特性[1-2]。肉桂醛具有典型香氣，直接加入食品中會有令人不適的氣味，降低食品的感官品質[3]，但肉桂醛因水溶性低，易揮發，易氧化，穩定性差，在食品加工中的應用受限[4]。采用微膠囊技術，如脂質體、納米乳和納米粒等[5]方法對肉桂醛進行預處理，可以掩蓋其不良風味，避免或減輕其典型氣味對加工食品感官品質的影響，同時可以改善精油的溶解性和穩定性。

脂質體是由脂質分子在水溶液中形成的具有雙分子層結構的囊泡，可以同時包裹脂溶性物質和水溶性物質。脂質體在水中的分散性好、生物相容性高，并且被脂質體包埋的物質擴散率低、釋放緩慢[6-8]。因此，將活性物質包封到脂質體中可保留其功能活性并提高其在加工和貯藏過程中的穩定性[9-10]。

乙醇注入法是一種將磷脂溶液注入到水相中，無需添加有機溶劑，且無任何中間過程即可快速形成脂質體的脂質體包埋優選方法。與其他方法相比，該方法不僅可以避免使用有毒溶劑(如三氯甲烷、甲醇)，且得到的脂質體粒徑更小、分散性更佳，貯藏性能良好，操作簡便易行、重現性好[11-14]。Sebaaly等[9]用乙醇注入法制備了包封率為86.6%的丁香精油脂質體，脂質體表現出納米級的球形囊泡，貯存兩個月后粒徑從(260.0±4.8) nm增加到(367.0±12.9) nm，包封率保持不變，具有一定的穩定性。Toniazzo等[15]研究表明，通過乙醇注入法制備的槲皮素脂質體，貯藏100 d后槲皮素濃度未下降，具有較長的保存期。

研究擬以肉桂醛為原料通過乙醇注入法制備肉桂醛脂質體，在單因素試驗的基礎上，以蛋黃卵磷脂質量濃度、蛋黃卵磷脂與膽固醇質量比、蛋黃卵磷脂與肉桂醛質量比為考察因素，以肉桂醛脂質體的包封率為響應值，采用響應面分析法，確定制備肉桂醛脂質體的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器與試劑

蛋黃卵磷脂：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

膽固醇、吐溫80：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

肉桂醛：≥95%，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

無水乙醇、正己烷：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

恒流泵：HL-2S型，上海青浦滬西儀器廠；

旋轉蒸發器：RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外分光光度計：UV-1800型，上海美普達儀器有限公司；

納米粒度及zeta電位儀：Litesizer 500型，奧地利安東帕公司。

1.2 方法

1.2.1 肉桂醛脂質體的制備 采用乙醇注入法[16]。按一定質量比稱取蛋黃卵磷脂、膽固醇和肉桂醛，加入10 mL 無水乙醇，45 ℃水浴直至完全溶解，隨后將有機相通過恒流泵注入到預熱45 ℃的40 mL水化介質中，置于磁力攪拌器上水化30 min。通過旋轉蒸發儀除去無水乙醇(水浴溫度45 ℃)。制備的脂質體在4 ℃下保存。

1.2.2 單因素試驗 分別研究蛋黃卵磷脂質量濃度(1，2，4，6，8 mg/mL)，蛋黃卵磷脂與肉桂醛的質量比(m蛋黃卵磷脂∶m肉桂醛為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1)，卵磷脂與膽固醇的質量比(m蛋黃卵磷脂∶m膽固醇為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1)，乙醇注入速度(0.033 8，0.071 9，0.103 0，0.133 0，0.167 0 mL/s)4個因素對脂質體包封率、粒徑及多分散指數(PDI)的影響。各因素固定時的取值為磷脂質量濃度2 mg/mL、m蛋黃卵磷脂∶m肉桂醛為6∶1、m蛋黃卵磷脂∶m膽固醇為6∶1、注射速度0.133 0 mL/s。

1.2.3 響應面優化試驗 根據單因素試驗結果選取影響較顯著的3個因素為變量，包封率為響應值，設計三因素三水平的響應面優化試驗。

1.2.4 貯藏穩定性試驗 將制備好的肉桂醛脂質體置于常溫和4 ℃條件下分別貯藏0，7，14，21，28 d，測定其包封率的變化。

1.2.5 包封率及載量的測定

(1) 總肉桂醛標準曲線繪制：準確稱取肉桂醛11.4 mg，加入1 mL吐溫80—乙醇溶液[m吐溫80∶V乙醇=1∶10 (g/mL)]使其溶解，加入9 mL水，搖勻。分別精確稱取10，20，30，35，40 μL于10 mL容量瓶中，用吐溫80—乙醇溶液[m吐溫80∶V乙醇=1∶100 (g/mL)]稀釋至刻度，搖勻，于287 nm處測定吸光值，得到標準曲線。

(2) 游離肉桂醛標準曲線繪制：準確稱取肉桂醛14.9 mg加入10 mL無水乙醇溶解，搖勻。分別量取4，5，10，20，30 μL上述溶液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，于287 nm處測定吸光值，得到標準曲線。

(3) 總肉桂醛含量測定：取0.5 mL肉桂醛脂質體于10 mL容量瓶中，加入1 mL吐溫80—乙醇溶液[m吐溫80∶V乙醇=1∶10 (g/mL)]，漩渦振蕩30 s后加去離子水補足10 mL，同法不加肉桂醛制作空白脂質體作為對照，于287 nm處測定吸光值。

(4) 游離肉桂醛含量測定：取0.5 mL肉桂醛脂質體，加入3 mL正己烷，漩渦振蕩2 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液，重復上述步驟2次，將收集的上清液加入正己烷至10 mL，同法以空白脂質體作對照，于287 nm處測定吸光值。分別按式(1)、式(2)計算肉桂醛的包封率和載量。

(1)

(2)

式中：

EE——肉桂醛包封率，%；

LC——肉桂醛載量，%；

M1——產品中肉桂醛總含量，mg；

M2——游離肉桂醛含量，mg；

M0——初始肉桂醛添加量，mg；

M3——產品中的脂質含量，mg。

1.2.6 粒徑、多分散指數(PDI)及zeta電位的測定 用蒸餾水將樣品稀釋10倍后取適量樣品于樣品池中，使用納米粒度及zeta電位儀分別測定其粒徑、PDI及zeta電位。

1.3 數據分析

使用Design-Expert 8.0.6和Excel軟件進行數據分析，使用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 肉桂醛標準曲線

由圖1可知，總肉桂醛標準曲線為y=0.192 2x-0.057 8，R2=0.992 3，線性質量濃度范圍為1.143～4.571 μg/mL。游離肉桂醛標準曲線為y=0.185 3x+0.024 5，R2=0.994 6，線性質量濃度范圍為0.059 6～5.960 0 μg/mL。

圖1 肉桂醛標準曲線Figure 1 Standard curve of cinnamaldehyde

2.2 單因素試驗

2.2.1 蛋黃卵磷脂與膽固醇質量比對脂質體的影響 由圖2(a)可知，隨蛋黃卵磷脂與膽固醇質量比值增大，肉桂醛脂質體的包封率呈先增大后減小趨勢，當m蛋黃卵磷脂∶m膽固醇為6∶1時，包封率達到最大。由圖2(b)可知，隨蛋黃卵磷脂與膽固醇質量比值增大，粒徑呈先減小后增大趨勢，PDI均小于0.3，粒徑較均勻分布。這是由于在磷脂雙層中，膽固醇分子通過磷脂的脂性酰基鏈的羰基與膽固醇羥基頭之間的氫鍵相互作用，保持著與磷脂分子處于平行排列的位置[13]。這種相互作用降低了磷脂雙層中分子流動性，增強了膜的剛性和致密度，在水合過程中提高了脂質體膜的穩定性，因此在適當范圍內增加膽固醇含量會增加肉桂醛的包封率，同時減小脂質體的聚集，減小了脂質體的粒徑。而當膽固醇量過多時，嵌入脂質雙層的膽固醇增多，會降低肉桂醛插入的空間，同時膽固醇也具有一定的乳化性，當膽固醇比例過大時，反而不利于脂質體膜的形成，只會增大脂質體的粒徑，降低肉桂醛的包封率[17-18]。因此，當m蛋黃卵磷脂∶m膽固醇為6∶1時，肉桂醛包封率與載量達到最大，粒徑較小，體系穩定，這與Yuan等[19]的研究結果一致。

圖2 磷脂與膽固醇質量比對脂質體包封率、載量、粒徑及 PDI的影響Figure 2 Effect of mass ratio of phospholipid to cholesterol on liposome encapsulationefficiency，loading content, particle size and PDI

2.2.2 蛋黃卵磷脂質量濃度對脂質體的影響 由圖3(a)可知，過高或過低的蛋黃卵磷脂質量濃度均導致肉桂醛包封率下降。由圖3(b)可知，隨著蛋黃卵磷脂質量濃度的增加，粒徑呈增大趨勢，PDI呈先減小后增大趨勢，與Jaafar-Maalej等[20]的研究結果一致。這是由于注射溶液中的磷脂濃度越低，所形成脂質體的粒徑越低，當磷脂乙醇溶液注入到水相中時，脂質分子聚集并形成被稱為“雙層磷脂片段(BPFs)”的中間結構，隨磷脂濃度增加，所形成的BPFs的濃度也會增加，因此提高了它們的聚結機率，并增加了較大脂質體形成的可能性[21]。當蛋黃卵磷脂質量濃度為2 mg/mL時，脂質體的包封率和載量均達到最大，粒徑及PDI較低。

圖3 磷脂質量濃度對脂質體包封率、載量、粒徑及PDI的影響Figure 3 Effect of mass concentration of phospholipid on liposome encapsulationefficiency,loading content, particle size and PDI

2.2.3 蛋黃卵磷脂與肉桂醛質量比對脂質體的影響 由圖4(a)可知，隨肉桂醛含量增加，包封率呈先增大后減小趨勢，載量呈上升趨勢，與Yuan等[19]的研究結果一致。當m蛋黃卵磷脂∶m肉桂醛為6∶1時，包封率達到最大值。一定數量的脂質體對肉桂醛的承載能力有限，所以當肉桂醛添加量較低時，脂質體有足夠的空間來容納肉桂醛，導致其包封率較高，繼續增加肉桂醛含量，超過脂質體的負荷，包封率反而下降[22]。由圖4(b)可知，當肉桂醛添加量增多時，脂質體粒徑不斷增大，可能是由于親脂性化合物在膜的疏水性部分的積累會干擾磷脂之間的相互作用，導致雙分子層膨脹[9]。各個條件下PDI均小于0.3，且無明顯變化。因此，綜合考慮選擇蛋黃卵磷脂與肉桂醛質量比為6∶1。

圖4 磷脂與肉桂醛質量比對脂質體包封率、載量、粒徑及PDI的影響Figure 4 Effect of mass ratio of phospholipid to cinnamaldehyde on liposome encapsulationefficiency,loading content, particle size and PDI

2.2.4 注射速度對脂質體的影響 由圖5(a)可知，注射速率對脂質體的包封率無顯著影響。無論乙醇的注入速度如何，均能引起磷脂在水相的快速擴散，并逐漸形成脂質體，而不會影響磷脂/膽固醇對肉桂醛的包封[23]。由圖5(b)可知，隨注射速度增加，脂質體粒徑不斷減小，這主要是因為速度越快，磷脂雙分子層結合越快，越有可能形成小的脂質體囊泡[24]。PDI均小于0.3，說明在此條件下，脂質體均一性良好。

圖5 注射速度對脂質體包封率、載量、粒徑及PDI的影響Figure 5 Effect of injection velocity on liposome encapsulationefficiency, loading content, particle size and PDI

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結果 根據單因素試驗結果，以對肉桂醛脂質體包封率影響較大的磷脂濃度、磷脂與膽固醇質量比、磷脂與肉桂醛質量比為響應變量(表1)，脂質體包封率(Y)為響應值。不同試驗條件下脂質體包封率如表2所示。

表1 響應面設計試驗因素及水平Table 1 Response surface design experimental factors and levels

表2 響應面試驗的設計和結果Table 2 Design and results of response surface experiment

對響應面結果進行回歸擬合，得到包封率與各因素的二次回歸方程：

Y=85.25+4.12A-1.07B+4.69C-2.02AB+2.32AC+2.17BC-19.98A2-2.61B2-6.54C2。

(3)

2.3.2 回歸模型方差分析 由表3可知，回歸模型的P值顯著(P<0.05)，而失擬項不顯著(P>0.05)，說明模型是精確和適用的。二次回歸模型決定系數R2=0.991 8，表明該模型在試驗驗變量范圍內具有極高的擬合能力。各因素對肉桂醛脂質體包封率的影響大小為：C>A>B。在該表中，線性系數(A、C)、二次項系數(A2、B2、C2)和相互作用系數(AB、AC、BC)對包封率有顯著影響(P<0.05)。

表3 回歸模型及方差分析?Table 3 Regression model and variance analysis

2.3.3 響應面優化與分析 由圖6可知，A與C的交互作用較明顯，曲面凸起較大，對包封率的影響較大，而B與C對包封率的影響較小。通過響應面分析得到最佳制備條件為：磷脂質量濃度2.69 mg/mL、m蛋黃卵磷脂∶m肉桂醛為6.73∶1.00和m蛋黃卵磷脂∶m膽固醇為5.79∶1.00。在此條件下，制備的肉桂醛脂質體包封率為82.37%，粒徑為113.89 nm，PDI為0.2，與模型相符。

圖6 各參數交互作用對包封率的影響Figure 6 The influence of interaction of different factors on encapsulationefficiency

2.4 貯藏穩定性試驗

由圖7可知，隨貯藏時間延長，脂質體包封率不斷下降，貯藏28 d后，在常溫下，包封率從78.9%下降到57.5%，在4 ℃時，包封率從78.0%下降到70.7%，肉桂醛在常溫下比4 ℃時溶出更快，主要是因為在常溫下脂質體膜有更高的滲透率，導致肉桂醛從脂質體的疏水區域釋放出來[25]，低溫下包封率較高可能是由于膜的通透性的降低，以及低溫下磷脂分子遷移率的降低，在4 ℃貯藏條件下，脂質體在28 d后仍有較高的包封率。

圖7 不同溫度下肉桂醛脂質體的貯藏穩定性

3 結論

在單因素試驗的基礎上通過響應面法對肉桂醛脂質體的制備工藝進行優化，結果表明，最佳的工藝條件為磷脂質量濃度2.69 mg/mL，m磷脂∶m肉桂醛為6.73∶1.00以及m磷脂∶m膽固醇為5.79∶1.00，在此條件下制得肉桂醛脂質體的包封率為82.37%，粒徑為113.89 nm，多分散指數為0.20，zeta電位為-29.07 mV。響應面優化的二次模型可以較好地預測肉桂醛脂質體的制備條件和包封率之間的關系。貯藏試驗表明,在4 ℃下比在常溫下貯藏具有更高的穩定性，貯藏28 d后，在4 ℃下貯藏的脂質體仍有較高的包封率。試驗證明經乙醇注入法制備的脂質體具有較高的包封率，粒徑較小，分布均勻，并且在一定貯藏時間下仍有較高的包封率。盡管如此，脂質體在體內和體外的穩定性仍然存在一定問題，因為在貯藏期間或給藥后，脂質體傾向于降解或聚合，而導致包合物的泄漏。為了克服這些問題，后續將采用聚合物對脂質體的表面進行修飾以提高其環境的適應性。