內蒙古傳統發酵乳制品中乳酸菌的分離及其耐藥性研究

韓慧玲，李 華，包振江，趙家齊，李 晴，袁曉霞，冀照君*

（內蒙古民族大學 生命科學與食品學院，內蒙古 通遼 028000）

內蒙古通遼地區的牧民長期以來沿用傳統的自然發酵方法制作具有民族特色的傳統發酵乳制品，主要有奶豆腐、酸馬奶、酸性奶油（烏日莫）、奶皮子等，這些傳統乳制品工藝獨特、品種繁多、味道極美、營養豐富，并較好地保存了當地自然環境中的乳酸菌，曾經是皇帝王室的貢品，至今還是蒙族地區最重要的主食，該地區獨特的氣候、環境和食品的特色加工方法使得傳統發酵乳制品中乳酸菌資源十分豐富[1-2]。有研究表明，新疆、青海、西藏地區傳統發酵乳制品中的優勢菌群分別為瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）[3]，內蒙古西部地區傳統發酵乳制品中的優勢菌群為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsplactis）[4-5]。這些乳酸菌對腸道內病原菌生長和定殖有抑制作用，對維持腸道健康有著重要作用[6-7]，被公認為安全性（generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]。因此，內蒙古東部地區傳統發酵乳制品中豐富的乳酸菌資源尚待進一步開發利用。

近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性問題越來越嚴重，已由多重耐藥性發展為普遍耐藥性[9]。有研究表明，乳酸菌對萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環素、環丙沙星等藥物具有較強的耐藥性，且部分菌株具有多重耐藥性[10]，但乳酸菌對各種抗生素的耐藥性因樣品來源、生存環境等差異顯著[11-14]。因此，研究傳統發酵乳制品中乳酸菌的耐藥性具有重要的意義。

本研究以內蒙古通遼地區自制的奶豆腐和酸性奶油（烏日莫）兩種傳統發酵乳制品為材料，采用稀釋涂布法從中分離純化乳酸菌，借助保守序列16S rRNA鑒定乳酸菌種屬關系，并采用8種常見抗生素藥敏性實驗深入分析乳酸菌的耐藥率和多重耐藥性，為傳統發酵乳制品中乳酸菌安全性評價提供重要參考，為乳酸菌耐藥分子機制和優良乳酸菌資源開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

奶豆腐（NDF）和烏日莫（WRM）兩種自制傳統發酵乳制品均采集自內蒙古通遼地區的牧民家庭。

1.1.2 培養基

MRS固體培養基[7]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。121 ℃滅菌20 min。MRS液體培養基中不添加瓊脂。

1.1.3 藥敏紙片及主要試劑

氯霉素（chloramphenicol，C）、萬古霉素（vancomycin，VA）、四環素（tetracycline，T）、鏈霉素（streptomycin，SM）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampicin，RD）、萘啶酸（nalidixic acid，NA）、紅霉素（erythromycin，EM）抗生素藥敏試紙：杭州濱和微生物試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市致遠化學試劑廠；瓊脂糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸錳（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；無水乙酸鈉（分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；2×Master Mix：北京擎科新業科技有限公司。

1.2 儀器與設備

3K-15型臺式高速離心機：德國Sigma公司；Mastercycler nexus PCR擴增儀：德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀：北京六一電子儀器廠；ProteinSimple凝膠成像系統HP：美國ProteinSimple公司；DZF-6051型生化培養箱：寧波市東南儀器有限公司；BS-1E型振蕩培養箱：蘇州威爾實驗用品有限公司；LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司；V8型漩渦混合器：美國Essenscien公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的分離與純化

將奶豆腐樣品置于無菌研缽中搗碎后待用，準確稱取奶豆腐、烏日莫樣品10.0 g于90 mL無菌生理鹽水（含量為0.9%）中，充分振蕩5 min，使樣品與生理鹽水混合均勻[15]。采用10倍系列梯度稀釋法將樣品稀釋至10-3，取稀釋度為10-1、10-2、10-3的樣品分別涂布于MRS固體培養基上，每個梯度做3次平行[16]，37 ℃靜置培養48 h后，根據乳酸菌菌落特征，挑取單菌落并純化2次，將純化菌株保存于20%甘油中，-80 ℃冷凍保存備用。

1.3.2 分子生物學鑒定

采用異硫氰酸胍（guanidine thiocyanate，GUTC）法提取乳酸菌的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[17]。以其為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，對其16SrRNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Mix（含Loading）23.00 μL、引物27F和1492R各1.00 μL、DNA模板2.00 μL，以雙蒸水（ddH2O）補至50.00 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環30次；72 ℃再延伸10 min。取PCR擴增產物3.00 μL，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將單一條帶的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果提交到美國國立生物技術信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment searchtool，BLAST）進行同源性比對，鑒定菌株的種屬關系。

1.3.3 抗生素耐藥性敏感試驗

首先將乳酸菌菌株活化，挑取單菌落于MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養48 h，將菌液用無菌水調整至OD600nm值為1.0的菌懸液。然后將15 mL MRS固體培養基倒入培養皿中，待培養基凝固后，取200 μL菌懸液加入4 mL 0.6%瓊脂，45 ℃混勻，均勻涂布于MRS固體培養基上，于室溫放置15 min。最后在無菌條件下取出藥敏紙片，置于固體培養基上（每皿3個相同藥敏紙片），37 ℃培養48 h后，測量并記錄抑菌圈直徑。根據臨床實驗室標準化協會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）（2018）和《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》第十七版信息增刊提供的紙片法標準，制定評價乳酸菌對抗生素的耐藥性標準，具體判定標準見表1。

表1 藥敏紙片種類、含藥量及判定標準Table 1 Types,drug contents and determination standards of drug sensitive paper

1.3.4 耐藥率的計算

菌株的耐藥率[18]計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

采用稀釋涂布法從內蒙古通遼地區自制的奶豆腐和烏日莫中共分離得到80株乳酸菌，部分典型菌株的菌落形態及革蘭氏染色鏡檢觀察結果見圖1。

圖1 部分分離菌株的菌落形態（a）及革蘭氏染色結果（b）Fig.1 Colony morphology (a) and Gram staining results (b) of some isolated strains

由圖1可知，乳酸菌菌落在MRS固體培養基上多呈圓形，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊；所有菌株鏡檢結果均呈革蘭氏陽性，細胞形態多樣。

2.2 乳酸菌的分子生物學鑒定

分離乳酸菌的分子生物學鑒定結果見表2。由表2可知，經16S rRNA基因測序與鑒定，80株乳酸菌歸屬于13個種，分別為短乳桿菌（7株）、糞腸球菌（5株）、乳酸片球菌（2株）、乳酸乳球菌（12株）、瑞士乳桿菌（4株）、屎腸球菌（13株）、戊糖片球菌（5株）、副干酪乳桿菌（7株）、食二酸乳桿菌（4株）、奧塔基乳桿菌（5株）、耐久腸球菌（4株）、植物乳桿菌（6株）、開菲爾乳桿菌（6株），表明內蒙古東部地區傳統發酵乳制品中乳酸菌生物多樣性較高。

表2 分離乳酸菌的分子生物學鑒定結果Table 2 Molecular biological identification results of isolated lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐藥性結果與分析

2.3.1 乳酸菌藥敏紙片結果

分離得到的80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性見表3。

由表3可知，利福平、鏈霉素、紅霉素、四環素、環丙沙星、萬古霉素、奈啶酸、氯霉素抗性培養基上無抑菌圈（耐藥（R））的乳酸菌分別是36株、59株、13株、26株、49株、53株、80株、16株，這些乳酸菌對相應抗生素表現出強耐藥性；抑菌圈直徑較大（敏感（S）型）的菌株數分別為39株、4株、59株、43株、11株、22株、0株、61株，這些菌株對相應抗生素表現出強敏感性。另外，有7株乳酸菌（L.brevisIMUNJL0111、E.faecalisIMUNJL0096、E.faecalisIMUNJL0039、L.acidilacticiiIMUNJL0115、E.faeciumIMUNJL0213、E.faeciumIMUNJL0226、E.faeciumIMUNJL0229）對所有8種抗生素均無抑菌圈（強耐藥性）。由此可見，從內蒙古通遼地區傳統發酵乳制品中分離得到的80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性差異顯著，部分菌株表現出強耐藥性，部分菌株表現出強敏感性，這可能與菌株自身的固有性耐藥以及外部環境的影響有關[19]。

表3 80株乳酸菌對8種抗生素的耐藥性結果Table 3 Drug resistance results of 80 strains of lactic acid bacteria to 8 antibiotics

續表

續表

2.3.2 乳酸菌對不同抗生素的耐藥率分析

13個乳酸菌菌種對8種抗生素的耐藥率見表4。

表4 乳酸菌對8種抗生素的耐藥率Table 4 Drug resistance rates of lactic acid bacteria to 8 antibiotics

由表4可知，80株乳酸菌對抗生素的耐藥率由高到低依次為萘啶酸（100%）、鏈霉素（95.00%）、環丙沙星（80.00%）、萬古霉素（72.50%）、利福平（51.25%）、四環素（45.00%）、紅霉素（26.25%）、氯霉素（23.75%）。13種乳酸菌對8種抗生素的耐藥率差異明顯。乳酸片球菌對萘啶酸、利福平、鏈霉素、四環素、環丙沙星、萬古霉素的耐藥率均為100%；戊糖片球菌對鏈霉素、環丙沙星、萬古霉素、萘啶酸的耐藥率均為100%；副干酪乳桿菌對鏈霉素、萬古霉素、萘啶酸的耐藥率均為100%。然而，植物乳桿菌對紅霉素、萬古霉素、氯霉素的耐藥率均為16.67%，耐藥率較低；奧塔基乳桿菌（對紅霉素、四環素、氯霉素的耐藥率為0）、耐久腸球菌（對紅霉素和萬古霉素的耐藥率為0）、戊糖片球菌和副干酪乳桿菌（對紅霉素耐藥率為0）對不同抗生素表現出高度的敏感性。

上述結果與新疆北部[16]、西藏[20-21]、內蒙地區[22]發酵乳制品中分離出的乳酸菌耐藥性高度一致，均發現植物乳桿菌、副干酪乳桿菌對鏈霉素耐藥，對四環素、紅霉素敏感，這表明傳統發酵乳制品中的乳酸菌在遺傳分化過程中具備一定的固有耐藥能力，這與乳酸菌基因組上的大環內酯-林肯酰胺類ML（ermA，ermB，msrA/B，lnuA）及四環素類（tetM，tetK）、氨基糖苷類（aac（6'）-aph（2″），aph（3'）-III，strA，strB）、β-內酰胺類（blaZ）、氯霉素（cat）和萬古霉素（vanX）等耐藥基因有關[23-24]。然而，河南新鄉市售酸奶中分離出的乳酸菌對四環素（61.3%）的耐藥率更高，并檢測到乳酸菌具有四環素耐藥基因tetM[25]；廣州市售酸奶中的乳酸菌對環丙沙星和萬古霉素耐藥率只有54.17%～35.42%，對四環素、青霉素、氯霉素、紅霉素和利福平的耐藥率均較低或完全敏感[19]。因此，乳酸菌抗生素耐藥性可能與地理位置、樣品來源、污染程度等均有關，也可能與其耐藥基因沉默或表達不充分有關[26-27]，有待于更深入研究。

2.3.3 乳酸菌多重耐藥性分析

13個乳酸菌菌種的多重耐藥性分析結果見表5。

表5 乳酸菌的多重耐藥率Table 5 Multiple drug resistance rates of lactic acid bacteria

由表5可知，76株（95%）乳酸菌具有多重耐藥性，其中短乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、瑞士乳桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌、副干酪乳桿菌、食二酸乳桿菌、奧塔基乳桿菌、開菲爾乳桿菌均表現為抗3種及以上抗生素，表明這10個種的乳酸菌具有較強的耐藥性，比前期研究結果中具有多重耐藥性的乳酸菌所占比例（90.3%和70.33%）更高[28-29]，可能是由于具有多重耐藥性的乳酸菌對自然環境的適應能力更強[30]。此外，有11株（13.75%）乳酸菌（短乳桿菌1株、糞腸球菌2株、乳酸片球菌1株、乳酸乳球菌2株、瑞士乳桿菌1株、屎腸球菌3株、植物乳桿菌1株）具有8重抗生素耐藥性，表明該地區傳統發酵乳制品中的乳酸菌資源多重耐藥性現象十分普遍。這可能與農牧區飼養動物長期接觸抗菌藥物有關，致使傳統發酵乳制品中抗生素殘留量較高，耐藥型菌株大量繁殖，以及抗性基因或R質粒[31-32]在菌株間橫向轉移使乳酸菌由單重耐藥演化為多重耐藥[33]。

3 結論

采用稀釋涂布法從內蒙古通遼地區自制的奶豆腐和烏日莫中共分離純化出80株乳酸菌，經16S rRNA序列分析，歸屬于13個種，分別為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、乳酸片球菌（Lactobacillus acidilacticii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、屎腸球菌（Enterococcusfaecium）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、食二酸乳桿菌（Lactobacillus digitalis）、奧塔基乳桿菌（Lactobacillusottaki）、耐久腸球菌（Enterococcus durans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefir），說明內蒙古通遼地區傳統自然發酵乳制品中具有非常高的生物多樣性。80株乳酸菌對萘啶酸的耐藥率為100%，對鏈霉素、環丙沙星、萬古霉素、紅霉素、氯霉素的耐藥率分別為95.00%、80.00%、72.50%、26.25%、23.75%。此外，76株（95%）乳酸菌具有多重耐藥性（≥3種抗生素培養基上判斷為耐藥或中敏），這表明內蒙古傳統發酵乳制品中的乳酸菌抗生素耐藥性問題非常突出。因此，抗生素的使用頻率和劑量將致使傳統發酵乳制品中乳酸菌耐藥性改變，今后應加強對傳統發酵乳制品的耐藥監測和溯源，制定嚴格的衛生標準。