產果香風味酵母的分離鑒定及其生長特性分析

孔垂琴，范洪臣*，唐 慧，石彥國，張 娜

（哈爾濱商業大學 食品工程學院 黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

精釀啤酒（craft beer）也稱為工坊啤酒，指由生產規模較小的商業化企業或作坊生產且釀造工藝、原料、酵母種類獨特的啤酒產品[1]。目前，果味啤酒是新型工坊啤酒開發的熱點，如比利時和林德曼啤酒[2]。為增加啤酒中的果香味，釀造工藝中常添加果汁、酒花和產香酵母以提升風味[3-4]，其中產香酵母菌起到關鍵作用[5]。

產香酵母主要包括漢遜酵母（Hanseniasporasp.）、球擬酵母（Torulopsissp.）、克勒克酵母（Kloeckerasp.）、假絲酵母（Candidasp.）和畢赤酵母（Pichiasp.）等[6-8]，其在發酵過程產生的酯類、高級醇和低級脂肪酸等能夠賦予啤酒濃郁的醇、酯香味[9-12]。產香酵母在發酵過程中能生成大量風味物質前體物，何松等[13]采用非釀酒酵母發酵水蜜桃，發現果酒中產生了大量的芳香類物質，改善了果酒的發酵風味。目前，精釀果啤生產所使用的酵母多為工業用啤酒酵母，使用單一啤酒酵母發酵會造成產品風味單調、口味平淡[14-15]，非釀酒酵母和商業化啤酒酵母混合使用在保證了精釀啤酒基礎風味的前提下可增加酯香風味物質[16-18]。因此，產香酵母菌種的優化、培育、篩選對啤酒品質具有重要的意義[19]。目前，已發現的生香酵母大多從固態酒、調味品釀造中分離而來[20]，而從谷物中篩選出產香酵母并應用到啤酒釀造中的研究鮮見報道。

因此，本研究利用嗅聞技術和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法檢測技術，從傳統谷物大米發酵液中篩選具有濃郁果香風味的酵母，通過形態觀察、生理生化試驗和分子生物學技術對其進行鑒定，并對其耐受性進行分析，以期為果香味精釀啤酒提供優良的酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大米發酵液：哈爾濱某工廠；大麥芽：哈爾濱廣匯生活超市。

1.1.2 試劑

ExTaq酶RR001：南京建成生物工程研究所；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、10×ExTaqBuffer：日本TaKaRa公司；引物：上海生物工程有限公司；DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：北京博邁德生物技術有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒：杭州愛思進生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

孟加拉紅固體培養基[4]：蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、孟加拉紅0.03 g/L、氯霉素0.1 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[9]：蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、蒸餾水1 L，固體培養基中添加2%的瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

麥芽汁糖化液[21]：將原料大麥芽粉碎調漿（料水比為1∶2（g∶mL））后，攪拌均勻，升溫至65 ℃糖化30 min，濾去纖維渣后煮沸15 min至糖度達12°Bx左右。

1.2 儀器與設備

YXQ-70A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司；H1650型醫用離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；JEI002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱、DHG-9203A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HDL型超凈工作臺：北京市東聯哈爾儀器制造廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州郎基科學儀器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；3730XL型測序儀：美國ABI公司；HP6890/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

在無菌條件下，取100 μL大米發酵液，采用無菌水按10倍梯度稀釋至10-6，分別取發酵稀釋液100 μL涂布于孟加拉紅固體培養基上，于28 ℃條件下培養24 h。待菌落長出后，挑取肉眼可見不同形態的單個菌落劃線接種于YPD固體培養基中，反復純化得到純菌落。

1.3.2 產果香酵母菌的篩選

將已純化的菌株分別接種于YPD固體培養基，28 ℃條件下培養48 h。由經過專業訓練的嗅覺靈敏的試驗人員與國家一級品酒師組成感官評價小組，采用嗅香技術對不同發酵培養基中的風味物質進行評價，以期篩選產香菌株[22]。

1.3.3 酵母菌產香發酵試驗

將產香菌株接種于YPD液體培養基，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h后。按照2%（V/V）的接種量將活菌數為2.32×108CFU/mL的產香菌液接種于麥芽汁糖化液中，在25 L發酵罐中混合均勻，于10 ℃條件下靜置發酵6 d，命名為樣品A，以未接菌的麥芽汁糖化液為空白組，命名為樣品a。

1.3.4 揮發性香氣物質的測定

采用GC-MS對樣品A、a的揮發性風味物質進行測定[23]。

樣品前處理：稱取適量樣品置于頂空瓶中，加3 mL飽和NaCl溶液密封，于80 ℃條件下平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min。待萃取結束后，萃取針在進樣口解吸5 min，萃取結束后采用分液漏斗分液，收集下層溶液并濃縮至5 mL，使用氣相色譜-質譜聯用儀測定揮發性風味物質。

色譜條件：TG-5MS非極性毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為起始溫度45 ℃保持4 min，以6 ℃/min的速率升至130 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速率升至240 ℃保持8 min；進樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣（He）（純度99.99%），流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：離子源溫度230 ℃；四級桿溫度180 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；掃描方式為全掃描；質譜掃描范圍為40～600 amu。

定性定量分析：采集到的質譜圖利用美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3.5 產果香酵母菌的鑒定

（1）形態學觀察

根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]，觀察并記錄產香酵母菌株的菌落顏色、形狀、大小、濕潤度、透明度、邊緣是否整齊、菌落質地等特征，記錄菌體形態、大小、出芽情況等，對產香菌株進行初步判斷。

（2）生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]和《真菌鑒定手冊》[25]對產香酵母菌株進行生理生化試驗。

（3）分子生物學鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取產香酵母菌株的DNA，以其為模板，采用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其ITS rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL，引物ITS1（10 μmol/L）2.0μL，引物ITS4R（10 μmol/L）個2.0 μL，DNA聚合酶0.5 μL，菌液2 μL，雙蒸水（ddH2O）34.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共25個循環；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。將測序得到的基因序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS rDNA基因序列，采用MAGE-x軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，并采用Bootstrapin法評估其準確性。

1.3.6 產果香酵母菌生長曲線的測定

將產香菌株接種于YPD液體培養基，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h作為種子液（菌體濃度2×107CFU/mL），備用。

按2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD培養基，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h，每2 h取樣測定OD600nm值，以發酵時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.7 產果香酵母菌株的耐受性試驗

葡萄糖耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產果香酵母菌的種子液分別接種于葡萄糖含量分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%的YPD培養基中，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h，測定OD600nm值。

酸耐受性：按2%（V/V）的接種量，采用乳酸調節YPD培養基pH值，將產果香酵母菌的種子液接種于pH分別為3.5、4.0、4.5、5.5、6.0的YPD培養基中，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h，測定OD600nm值。

乙醇耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產果香酵母菌的種子液接種于乙醇體積分數分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的YPD培養基中，28 ℃、120 r/min條件下培養24 h，測定OD600nm值。

溫度耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產果香酵母菌的種子液接種于YPD培養基中，分別于溫度為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃條件下，120 r/min培養24 h，測定OD600nm值。

1.3.8 數據處理

所有數據均平行測定3次，結果用“平均值±標準差”表示；利用SPSS26.0軟件進行數據處理；利用Origin 9.0軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 產果香酵母菌的分離篩選

通過平板涂布、劃線分離和嗅聞技術[26]，從大米發酵液樣品中分離篩選出一株產濃郁果香風味的酵母菌，命名為QL-2。

2.2 產果香酵母菌QL-2發酵液的香氣成分分析

采用GC-MS聯用法檢測樣品A和a的揮發性香氣成分，GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1，分析結果見表1。

圖1 產果香酵母菌QL-2發酵液中揮發性風味成分的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatographic of volatile flavor components in fermentation broth of fruity-producing yeast QL-2 analyzed by GC-MS

表1 產果香酵母菌QL-2發酵液中揮發性風味成分的GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis results of volatile flavor components in fermentation broth of fruity-producing yeast QL-2

續表

由圖1及表2可知，樣品中共檢測出36種揮發性風味成分。試驗組A中共檢出26種揮發性風味物質，包括酯類8種、醇類5種、酸類5種、醛類5種、酚類2種、呋喃類1種，相對含量分別為29.17%、51.72%、4.97%、3.64%、1.17%、5.51%。其中相對含量較高的是乙酸乙酯（23.26%）、乙醇（20.27%）、苯乙醇（20.07%）、異戊醇（7.80%）、2-正戊基呋喃（5.51%）、乙酸異丁酯（3.46%）、3-苯基丙烯酸（3.31%），推測濃郁梨清香和香甜味可能與乙酸乙酯和苯乙醇有關；空白組a中共檢測出25種揮發性風味物質，包括酯類1種、醇類6種、酸類6種、醛類6種、酮類1種、酚類4種和呋喃類1種，相對含量分別為0.10%、28.09%、5.56%、3.51%、2.95%、49.14%、0.29%，其中相對含量較高的風味物質是2,5-二叔丁基酚（25.32%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（18.10%），這兩種物質可能是麥芽汁的主要特征風味物質。通過對比發現，空白組的酚類相對含量較多，酯類含量較少，而發酵后的酯類和醇類生成相對較多，說明發酵前后酚類物質在發酵過程中發生了一系列反應生成具有特征風味物質的酯類，形成獨特的風味體系[26]，并且酵母菌在發酵過程中產生了大量的醇，導致發酵后醇類物質增多。由此可見，接入酵母菌株QL-2在麥芽汁糖化液中能增加果香風味物質，具有調節啤酒風味的作用。

2.3 產果香酵母菌的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

產果香酵母菌QL-2在YPD培養基上的菌落形態和細胞形態見圖2。由圖2可知，菌株QL-2的菌落中央凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤易挑起、呈現奶油狀；細胞呈橢球狀，單邊出芽。

圖2 菌株QL-2的菌落（a）及細胞（b）形態特征Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain QL-2

2.3.2 生理生化試驗

產果香酵母菌QL-2的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，在碳源同化試驗中，菌株QL-2能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、棉子糖、海藻糖、乙醇，不能利用纖維二糖、乳糖、鼠李糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇進行生長；在氮源同化試驗中，菌株QL-2能利用尿素、硝酸銨、硫酸銨，而不能利用亞硝酸鉀進行生長；除了吲哚試驗和尿素試驗結果呈現陽性外，重氮基蘭B試驗、脲酶試驗、甲基紅試驗、明膠水解試驗和硫化氫試驗結果皆為陰性，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]可初步判定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但僅通過生理生化還不能精確判斷到具體菌種，因此還需要進行分子生物學鑒定。

表2 菌株QL-2的生理生化試驗結果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain QL-2

2.3.3 分子生物學鑒定

基于ITS rDNA基因序列產果香酵母菌QL-2的系統發育樹見圖3。

圖3 基于ITS rDNA基因序列菌株QL-2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain QL-2 based on ITS rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株QL-2與屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（KC544499.1）等聚于一個分支，親緣關系最近，同時結合測序結果與NCBI數據庫中blast序列進行對比，發現菌株QL-2與菌株S.cerevisiae（KC544499.1）具有100%的相似度，并結合形態觀察、生理生化試驗，最終鑒定菌株QL-2為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.4 產果香釀酒酵母QL-2的生長特性

2.4.1 生長曲線

產果香釀酒酵母QL-2的生長曲線見圖4。由圖4可知，菌株QL-2在0～8 h處于延遲期，8～16 h為對數生長期，16 h后處于穩定期。

圖4 釀酒酵母QL-2的生長曲線Fig.4 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae QL-2

2.4.2 耐受性分析

（1）葡萄糖耐受性試驗

在麥芽汁發酵過程中，添加葡萄糖有利于酵母菌的生長，有利于在啤酒發酵后期酒精度和風味物質的增加，因此，葡萄糖耐受較好的酵母菌對于發酵至關重要。有研究表明，葡萄糖耐受較好的酵母菌能夠快速生長繁殖，延滯期更短，有利于工業化的生產[27]。釀酒酵母QL-2對葡萄糖的耐受性見圖5。由圖5可知，隨葡萄糖含量的增加，釀酒酵母QL-2的OD600nm值不斷降低，二者呈負相關。但在葡萄糖含量為60%時，釀酒酵母QL-2仍可生長，說明該菌種葡萄糖耐受性較好，具有良好的環境適應性，可用于工業生產發酵。

圖5 釀酒酵母QL-2的葡萄糖耐受性Fig.5 Glucose tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（2）酸耐受性試驗

李棒等[28]研究發現，釀酒酵母具有一定的酸耐受性有利于提升酵母的發酵速率，因此，酵母是否具有耐酸性對釀造啤酒品質具有至關重要的作用。釀酒酵母QL-2對酸的耐受性見圖6。由圖6可知，釀酒酵母QL-2可在pH為3.5～6.0的條件下生長，隨著環境pH不斷升高，菌株QL-2的OD600nm值呈現先升高后降低的趨勢，在pH為5.5時菌株的生長狀況最佳，pH為6.0時菌株的生長相對下降，說明該菌株可能更適合在稍酸的環境中生長且具有一定的耐酸性，可耐受pH 3.5。

圖6 釀酒酵母QL-2的酸耐受性Fig.6 Acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（3）乙醇耐受性試驗

耐乙醇能力強的酵母能夠促使發酵更加完全、徹底[29]。釀酒酵母QL-2對乙醇的耐受性見圖7。由圖7可知，釀酒酵母QL-2在乙醇體積分數為0～10%的范圍內均能生長，且在乙醇體積分數為6%時生長情況最佳，在乙醇體積分數為10%時生長相對下降但仍具有生長力，說明釀酒酵母QL-2具有一定乙醇耐受性。

圖7 釀酒酵母QL-2的乙醇耐受性Fig.7 Alcohol tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（4）溫度耐受性試驗

有研究表明，溫度會直接影響酵母的生長繁殖，如果溫度較高，酵母生長較快容易加速衰亡，風味物質也會相應減少；相反，一定的低溫條件有利于促進產香酵母產風味物質[30-31]。釀酒酵母QL-2對低溫的耐受性見圖8。由圖8可知，釀酒酵母QL-2在15～30 ℃范圍內均能生長，且在24 ℃條件生長情況最好，說明釀酒酵母QL-2具有一定的低溫耐受性，可耐受低溫15 ℃，通過對低溫發酵試驗結果進行嗅聞發現，該菌株在低溫條件下發酵確實能產生較怡人的風味物質，與之前嗅聞結果符合，可應用于麥芽汁低溫發酵豐富風味物質。

圖8 釀酒酵母QL-2的溫度耐受性Fig.8 Temperature tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

3 結論

通過嗅聞技術和GC-MS檢測技術從大米發酵液中篩選獲得1株產果香的酵母菌，編號為QL-2，利用該菌株發酵麥芽汁糖化液后發現呈果香風味物質的種類及含量增加，其中乙酸乙酯相對含量最高（23.26%）。通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定菌株QL-2為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），其對生長環境具有一定的耐受性，可在pH 3.5、乙醇體積分數10%、葡萄糖含量60%、溫度為15 ℃條件下正常生長，可作為理想的精釀啤酒產果香風味的酵母并應用到工業化生產。