紅棗核桃酸奶的貯藏品質及胃腸液環境下抗氧化研究

薛建娥，沈 輝，羅岳偉，蘭明珠，呂高鵬，白 建*

（呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033001）

紅棗是呂梁的特產之一，種植歷史悠久[1]。紅棗兼具藥食功能[2]，富含人體所需的六大營養素[3]，對食療保健、健脾益胃、延緩衰老等有很好的功效[4]。近年來，紅棗因富含生物堿、類黃酮、酚、萜類等有益營養成分而受到消費者的歡迎和青睞[5]。研究發現，紅棗中的三萜類化合物、環磷酸腺苷、黃酮類化合物、抗壞血酸和皂苷等多種生物活性成分在抑癌、抗過敏、降血壓和保護腸胃等方面具有重要作用[6-7]。

核桃也是呂梁地區特產之一，具有很高的營養價值[8]。核桃中含有大量的營養成分，其中包括六大營養素中的蛋白質、維生素、脂肪和礦物質[9]，其中不飽和脂肪酸的含量達到86%[10]。核桃是我國傳統的藥食兩用的佳品[11]，核桃仁在一定程度上可抑制腫瘤。核桃中富含的卵磷脂可以增強大腦功能，預防阿爾茲海默癥的發生[12]。同時，核桃仁中還含有豐富的α-亞麻酸（α-linolenic acid），α-亞麻酸在體內可以部分轉化為二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），在細胞受到自由基的氧化發生損害時發揮作用，是世界公認的抗衰老物質，也可以幫助大腦發育。隨著技術的進步，核桃產品中出現了核桃粉、核桃乳、核桃油等附加價值較高的產品，其中核桃乳深受大眾喜歡[13]。

酸奶既營養又健康，已成為世界上最受歡迎的乳制品[14]。酸奶中含有益生元和益生菌等成分，可以起到預防疾病和增強免疫系統的作用[15-16]，對于具有乳糖不耐癥的特殊人群，飲用酸奶不會像飲用牛奶一樣引起腹脹、腹瀉或產氣等現象[17]。同時還具有降低膽固醇、促進腸道蠕動、降血脂、提高免疫力等功效[18]。

本研究以紅棗、核桃、鮮奶等為主料，在鮮奶中加入保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行發酵，然后攪拌并加入核桃粉混勻，制成一款營養保健型酸奶。將紅棗核桃酸奶和空白對照酸奶進行對比研究，通過測定不同貯藏期兩種酸奶的理化指標，研究紅棗核桃酸奶和空白對照酸奶在胃、腸液的模擬環境反應后對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基的清除能力，初步探究其在模擬人體消化道環境中的抗氧化特性。以期進一步探究紅棗核桃酸奶的貯藏特性，提供貨架期的基本數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅棗、新鮮核桃、白砂糖、鮮牛奶：市售；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：均由呂梁學院生命科學系微生物實驗室提供。對照酸奶：不添加紅棗汁與核桃粉的同批鮮奶自制普通酸奶。

DPPH：濟南鑫貝生物技術有限公司；ABTS：山東華宏生物工程公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；硫酸鎂（化學純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸錳（分析純）：天津市致遠化學藥劑有限公司；檸檬酸銨、乙酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二銨（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：無錫市亞泰聯合化工有限公司；酚酞、吐溫-80（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FE20K pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX-250培養箱：躍進醫療器械有限公司；UV-1601分光光度計：瑞利分析儀器有限公司；SC-04離心機：中科中佳科學儀器有限公司；LDZX-50KBS蒸汽滅菌器：申安醫療器械廠；FA2104N分析天平：天津精密儀器有限公司；CM-5色差儀：柯尼卡美能達控股公司；KLG-9205A恒溫鼓風干燥箱：齊欣科學儀器有限公司；GJ200-4粉碎機、LC-JLQ-1C菌落計數器、NDJ-1指針式黏度計、LC-CP200×150破碎機：上海力辰儀器科技有限公司；HERPUSI壓榨機：九陽生活電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

核桃粉的制作[19]：選擇優良的核桃仁，使用恒溫（80 ℃）干燥箱烘烤180 min，烘干后核桃皮會變得比較脆，用手撕去外面的皮，這樣脫皮處理后使用粉碎機進行粉碎，過80目篩，成品即為核桃粉，備用。紅棗汁的制作[20]：選擇優質的紅棗，剔去其中有蟲害、空心、有蛆的紅棗，最終用水洗凈。經浸泡、預煮、破碎、壓榨等步驟提取紅棗汁，然后進行過濾濃縮，成品即為紅棗汁，備用。

1.3.2 菌種活化

將滅菌冷卻處理后的牛奶，裝入已滅菌試管中，接種3%保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）的凍干粉，將接種過的試管放置于42 ℃培養箱中，間隔一定時間并進行反復培養，直至符合生產發酵劑發酵4 h要求。

1.3.3 紅棗核桃酸奶制作工藝流程與操作要點

原料乳、紅棗汁與核桃粉混合攪拌→均質→加入白砂糖→殺菌→冷卻→加入發酵劑→攪拌均勻→恒溫培養→發酵→冷卻后熟→紅棗核桃酸奶

操作要點：

攪拌：將準備好的原料乳、紅棗汁與核桃粉混合，按照不規則順序攪拌3 min。

均質：在18 MPa的壓力下對混合液進行均質處理，時間為1 min。均質處理后，加入7%的白砂糖攪拌均勻。

殺菌：將紅棗核桃酸奶放置于90～95 ℃的加熱溫度下進行10 min的殺菌處理。

冷卻：殺菌后靜置，待其溫度下降至20 ℃。

接種：混合液中在無菌條件下加入3%的發酵劑（保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）攪拌均勻。

發酵：放置于42 ℃恒溫箱中發酵4～6 h，直至凝乳形成，冷卻。

冷卻后熟：待冷卻至常溫后將酸奶放入冰箱（4～6 ℃）中后熟24 h，即得紅棗核桃酸奶成品。

1.3.4 菌落總數的測定

乳酸菌活菌總數采用GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》測定。將發酵乳梯度稀釋后倒平板，37 ℃恒溫培養72 h，菌落計數器計數。

1.3.5 理化指標檢測

酸度：按GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》的方法測定。吸取10 g發酵乳放置于錐形瓶，使用20 mL蒸餾水進行稀釋，加2～3滴0.5%酚酞試劑搖勻，以0.1 mol/L的氫氧化鈉滴定至呈微紅色，且1 min不褪色。滴定酸度=氫氧化鈉消耗體積（mL）×10。pH：按GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》的方法測定。黏度：采用NDJ-1指針式黏度計直接測定。

色差：使用色差儀測定酸奶樣品的L*值、a*值和b*值。

持水力：取一定質量（W1）的酸奶于離心管；4 000 r/min離心12 min，棄上清液[21]，稱剩余物質質量（W2）。持水力計算公式如下：

1.3.6 抗氧化性檢測

（1）DPPH自由基清除率的測定

參照文獻[22-23]并進行調整。分別吸取樣品1 mL+0.1 mmol/L DPPH 5 mL于試管混合；吸取蒸餾水1 mL+0.1 mmol/L DPPH 5 mL混合；吸取樣品1 mL+無水乙醇5 mL置于試管混合。以上混合液均用振蕩器混勻，在20 ℃置于暗室反應30 min，4 000 r/min離心12 min，取上清液。使用分光光度計測量其吸光度值，波長為517 nm，做三組平行。計算DPPH自由基的清除能力，其計算公式如下：

式中：AS為樣品吸光度值；AC為對照組吸光度值；Ab為空白組吸光度值。

（2）ABTS自由基清除率的測定

參考已有的研究方法[24-25]并稍做修改。配制7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀，避光24 h，制成ABTS儲備液。用磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L，pH=7.4）稀釋，測量波長734 nm處的吸光度值。分別取樣品0.5 mL+ABTS稀釋液5 mL（樣品組AS）于試管；取樣品0.5 mL+PBS 5 mL（對照組AC）于試管；取蒸餾水0.5 mL+ABTS稀釋液5 mL（空白組Ab）置于試管。混勻后，置于暗室20 ℃靜置反應10 min，4 000 r/min離心12 min，取上清液，在波長734 nm處測量吸光度值。計算ABTS自由基的清除能力，其計算公式如下：

式中：AS為樣品吸光度值；AC為對照組吸光度值；Ab為空白組吸光度值。

1.3.7 制備模擬胃腸液

根據已有的研究并稍作修改制備模擬胃腸液[26-27]。模擬胃液：量取稀鹽酸8.2 mL、蒸餾水350 mL、胃蛋白酶5 g，混勻定容至500 mL備用。模擬腸液：用250 mL的水溶解3.4 g磷酸二氫鉀，使用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH至6.8；以適量水溶解5 g蛋白酶。將兩液混勻定容于500 mL容量瓶。

1.3.8 體外胃腸液消化模擬試驗

胃液環境模擬反應：取一份待測酸奶與兩份蒸餾水混合均勻，混合均勻后的溶液為樣品溶液，同時測定該樣品溶液的活菌數和抗氧化能力。取一份樣品溶液與一份模擬胃液混合均勻，在37 ℃環境下進行2 h水浴振蕩反應后，置于冰水中結束反應，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定活菌數和抗氧化能力。

腸液環境模擬反應：將胃液模擬反應完后的樣品取出，再與取一份模擬腸液與一份胃液模擬反應完后的樣品混合均勻，并在37 ℃環境下進行2 h水浴振蕩反應，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定活菌數和抗氧化能力。

1.3.9 數據處理

所有的基礎數據都使用Microsoft Excel 2010處理，作圖利用Graphpad Prism 8.0，顯著性分析使用SPSS 26.0軟件。

2 結果與分析

2.1 紅棗核桃酸奶貯存期間活菌數變化

酸奶作為含有活菌的發酵乳品，其中的乳酸菌對人體健康有著特殊的作用，如果活菌數量不達標，則難以發揮其在人體內的功效[28]。紅棗核桃酸奶及對照酸奶中的乳酸菌活菌數在4 ℃下貯藏21 d的變化情況見圖1。

圖1 兩種酸奶貯藏期間活菌數的變化情況Fig.1 Change of the viable count of two kinds of yogurts during storage

由圖1可知，紅棗核桃酸奶乳酸菌活菌數在1～7d時較高且無明顯差異（P＞0.05），14 d、21 d時下降；對照酸奶隨著貯藏時間的延長，活菌數逐漸降低。在1 d時，紅棗核桃酸奶的活菌數顯著高于對照酸奶（P＜0.05），分別為8.62 lg（CFU/g）、8.47 lg（CFU/g）。紅棗核桃酸奶在儲藏的21 d內，活菌數均高于對照酸奶，可能是由于紅棗和核桃中的成分對乳酸菌起到了保護作用。不僅如此，在試驗期間，紅棗核桃酸奶的活菌數一直保持在7.95 lg（CFU/g）以上，超過國標規定的發酵乳貨架期乳酸菌活菌數≥6.00 lg（CFU/g）的要求。

2.2 紅棗核桃酸奶貯存期間酸度變化

紅棗核桃酸奶及對照酸奶在4 ℃下貯藏21 d的pH、滴定酸度變化情況分別見圖2、圖3。

圖2 兩種酸奶貯藏期間pH的變化情況Fig.2 Change of pH of two kinds of yogurts during storage

圖3 兩種酸奶貯藏期間滴定酸度的變化情況Fig.3 Change of titrated acidity of two kinds of yogurts during storage

由圖2可知，紅棗核桃酸奶和對照酸奶隨貯藏時間延長，pH值均有不同程度的降低。在1 d時，紅棗核桃酸奶的pH為4.06，對照酸奶的pH為4.09，造成這種結果的原因是由于紅棗和核桃中的成分對pH產生了影響。兩種酸奶在貯藏14 d時，pH值出現了大幅下降。隨著時間延長酸奶的pH不斷下降，主要是酸奶中的發酵劑乳酸菌一直處于發酵狀態，產生大量乳酸引起的。21 d時兩者的pH無顯著差異（P＞0.05），可能與乳酸菌發酵的閾值有關。

由圖3可知，第1天時紅棗核桃酸奶的滴定酸度為80.50 °T，顯著高于對照酸奶的77.35 °T（P＜0.05）；7 d時對照酸奶的滴定酸度為98.60 °T，顯著高于紅棗核桃酸奶的92.40°T（P＜0.05），這是由于酸奶中含有的大量乳酸菌發酵產生乳酸引起的酸度變化，但紅棗核桃中的成分也會引起酸度的變化。14 d和21 d時，由于乳酸引起的酸度的變化而使兩種酸奶滴定酸度差異不顯著（P＞0.05）。21 d時紅棗核桃酸奶和對照酸奶滴定酸度均有所上升，這與乳酸菌發酵程度有關。

2.3 紅棗核桃酸奶貯存期間持水力和黏度變化

紅棗核桃酸奶及對照酸奶在4 ℃下貯藏21 d持水力、黏度的變化情況分別見圖4、圖5。

圖4 兩種酸奶貯藏期間持水力的變化情況Fig.4 Change of water holding capacity of two kinds of yogurts during storage

圖5 兩種酸奶貯藏期間黏度的變化情況Fig.5 Change of viscosity of two kinds of yogurts during storage

由圖4可知，兩種酸奶在儲存期間的持水力都呈現下降趨勢，可能是由于冷藏期間pH的變化以及凝膠結構的變化導致[29]。影響酸奶持水力的主要原因是酸奶中酪蛋白的含量；在整個實驗的4次測定中，紅棗核桃酸奶的持水力均顯著低于對照酸奶（P＜0.05），原因可能是添加了紅棗汁及核桃粉破壞了酸奶由酪蛋白顆粒構成的凝膠結構，降低了蛋白質分子之間的親和力，導致蛋白質膠體結合水的含量有所減少[30]，造成酸奶的持水力降低。另外，酸奶的持水力還與總固形物濃度有關，由于加入的紅棗汁含有大量水分，造成紅棗核桃酸奶的總固形物濃度下降，使其持水力低于對照酸奶。

由圖5可知，兩種酸奶的黏度都在1～14 d內隨著時間延長而降低，21 d均有所提高，但紅棗核桃酸奶的黏度的變化趨勢相對緩和，造成這種結果的原因是由于紅棗核桃中含有多糖，使酸奶的質地變得比較黏稠，產生了拉絲性的現象[31]；同時由于酸奶中蛋白質發生絮凝，把牛奶中的水分包裹起來，使得酸奶的阻力增大，從而導致體系的黏度較大。1 d時，紅棗核桃酸奶的黏度為1 900 mPa·s，顯著低于對照酸奶的2 248 mPa·s（P＜0.05）。對照酸奶在第7天的黏度迅速下降為1 322 mPa·s，7 d、14 d、21 d時紅棗核桃酸奶的黏度均顯著高于對照酸奶（P＜0.05）。黏度能夠體現酸奶內部分子間作用力的強度，酸奶中的各種成分相互作用，從而提高了酸奶的黏度；但隨著時間的推移，酸奶中的營養成分流失，從而黏度降低；而紅棗核桃酸奶中由于添加了紅棗、核桃，使酸奶內部分子間作用力更強，其黏度為1 725 mPa·s，相對于對照酸奶黏度1 300 mPa·s大，因此紅棗核桃酸奶的黏度明顯優于對照酸奶。

2.4 紅棗核桃酸奶貯存期間的色差對比

紅棗核桃酸奶及對照酸奶在4 ℃下貯藏21 d的顏色變化情況見表1。L*值為明亮度表示黑白，數值越大越白；a*值的正值為紅，負值為綠，0為中性；b*值的正值為黃，負值為藍，0為中性；ΔE*數值越大，表明色差明顯。

由表1可知，在貯藏期間，兩種酸奶的L*值都呈現上升的趨勢；紅棗核桃酸奶的a*值在1～7 d下降，14～21 d保持相對穩定，對照酸奶的a*值在1～14 d下降，14 d與21 d的a*值相同。貯藏期間，紅棗核桃酸奶的b*值總體上升，但在14 d時有所下降，對照酸奶的b*值平穩上升。1 d時對照酸奶的L*值為72.20，顯著高于紅棗核桃酸奶的68.47（P＜0.05），表明其顏色相對偏白，可能是紅棗中色素的存在以及核桃氧化變色導致的這一差異。進一步計算出1～7 d，7～14 d，14～21 d時紅棗核桃酸奶的總色差ΔE*分別為11.38、1.34、6.89，對照酸奶分別為0.08、3.78、0.57；紅棗核桃酸奶的顏色變化較為明顯。原因可能是一方面是因為紅棗中含有天然的棗紅色素，所以添加紅棗汁后酸奶的色澤加深；另一方面是因為紅棗中含有大量的還原糖，還原糖與蛋白質經過加熱發生了非酶棕色化反應，導致紅棗核桃酸奶的顏色變化，色差值明顯高于對照酸奶[32]。

表1 兩種酸奶在貯藏期間顏色指標的變化情況Table 1 Change of color indexes of the two kinds of yoghurts during storage

2.5 紅棗核桃酸奶貯存期間及胃、腸液模擬后抗氧化活性變化

DPPH、ABTS自由基清除率一定程度上反映了酸奶抗氧化的能力，紅棗核桃酸奶及對照酸奶在4 ℃下貯藏21 d的清除率分別見表2、表3。

由表2和表3可知，在冷藏過程中，隨著貯藏時間的延長，兩種酸奶的DPPH自由基的清除率先下降后保持穩定，而ABTS自由基清除率在前14 d呈現略微上升的趨勢，21 d時有所下降。總體上看，未經過胃腸液處理的情況下，紅棗核桃酸奶在貯藏過程中對兩種自由基清除率均顯著高于對照酸奶（P＜0.05）。這是由于紅棗中的酚類物質、維生素C等抗氧化成分發揮了作用，以及酸奶中乳酸菌的活菌數較高，可以使自由基清除率升高，是由于乳酸菌發酵能夠生成含有傳遞質子能力的化合物。另外，核桃中的蛋白質水解得到的產物具有抗氧化性，使自由基清除率升高[32]。

表2 不同處理對DPPH自由基清除率的影響Table 2 Effect of different treatments on DPPH free radical scavenging rate%

表3 不同處理對ABTS自由基清除率的影響Table 3 Effect of different treatments on ABTS free radical scavenging rate%

進一步分析可知，經過胃液模擬反應后，紅棗核桃酸奶的DPPH自由基清除率由73.56%下降到63.73%，ABTS自由基清除率由79.51%下降到63.01%；經過胃腸液模擬反應后，紅棗核桃酸奶的ABTS自由基清除率由74.66%下降到61.44%。由此可知經過胃液模擬反應和和腸液模擬反應后，都會導致兩種酸奶的DPPH和ABTS自由基清除能力下降，但下降程度有所不同。這可能是由于酸奶中的一些抗氧化物質在胃腸液環境下發生反應被分解。不僅如此，在1 d時，紅棗核桃酸奶經過胃液和胃腸液模擬反應后的ABTS自由基清除率，和未反應的普通酸奶的清除率差異顯著（P＜0.05）；在7 d、21 d時，紅棗核桃酸奶經過胃腸液模擬反應后的ABTS自由基清除率，和未反應的普通酸奶的清除率差異顯著（P＜0.05）；在14 d時，紅棗核桃酸奶經過胃液和胃腸液模擬反應后的ABTS自由基清除率，和未反應的普通酸奶的清除率差異顯著（P＜0.05）。

在紅棗中含有多種抗氧化物質（如黃酮、多酚等），可以有效增強酸奶的抗氧化能力，核桃中的多酚可抑制低密度脂蛋白的氧化活性，并且酸奶中的乳酸菌發酵也會產生抗氧化物質，從而促使抗氧化能力提高，這些均能體現紅棗核桃酸奶在模擬人體消化實驗中抗氧化能力的優勢。

3 結論

在低溫貯藏期間，紅棗核桃酸奶相比于對照酸奶的乳酸菌活菌數更高，pH低，黏度變化趨勢更穩定，但是紅棗核桃酸奶在保水性方面低于對照酸奶。此外，在不同貯藏期和胃、腸液模擬環境下，紅棗核桃酸奶的DPPH、ABTS自由基清除率均顯著高于對照酸奶。隨著貯藏時間的延長，兩種酸奶的自由基清除率都有所下降。總之，該研究證實了紅棗核桃酸奶在人體消化道內具有抗氧化作用。