植物乳桿菌發酵對沙棘原漿主要成分、抗氧化性及揮發性物質的影響

付依依，王永霞*，張笑瑩，李 月，譚志超，段盛林

（1.河北工程大學 生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；2.張北寶得康食品有限公司，河北 張家口 076450；3.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015）

乳酸菌發酵可以改善果汁的營養價值，賦予果汁調節腸道菌群平衡、提高機體免疫力等功效[1]。隨著人們對功能性食品的需求增加，乳酸發酵果蔬產品越來越受到人們的青睞。

近年來，將乳酸菌應用于高酸度果汁進行生物降酸的研究備受關注，研究發現，利用植物乳桿菌或酒酒球菌進行蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）可以達到較好的降酸效果[2-3]，這一發現可以解決高酸度漿果因蘋果酸含量較高帶來的口感酸澀的問題。

沙棘原漿富含黃酮、酚類化合物、維生素和脂肪酸等營養成分和功能成分，具有抗氧化、抗癌和降血脂等生物功效[4]。但因其過強的酸度和澀味，感官品質較低。因此，利用乳酸菌MLF可以實現提高沙棘原漿口感的目的，同時乳酸菌發酵對果汁風味也有明顯的提升作用。黃豪等[5]用不同乳酸菌發酵山楂汁，發現揮發性風味物質增加了20多種，其中以醇類為主。張璐等[6]分別用單一菌種和混合益生菌發酵獼猴桃汁，結果表明，混合菌種發酵的獼猴桃汁醇類、酯類的種類和含量增加更顯著。

有關沙棘原漿的MLF也有相關報道[7-9]，但結合發酵過程中揮發性成分變化的研究較少。為了明確植物乳桿菌對沙棘原漿的生物降酸效果及發酵過程對沙棘原漿抗氧化活性和風味的影響，本研究以沙棘原漿為原料，分析植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 14917發酵過程中糖、有機酸及總黃酮、總酚和揮發性風味化合物的動態變化，探究植物乳桿菌的MLF對沙棘原漿主要成份、抗氧化性及揮發性物質的影響，為開發兼具高營養價值和良好風味的發酵原漿提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原漿（可溶性固形物12.30%，初始pH2.70）：張北寶得康食品有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC14917凍干粉：上海保藏生物技術中心。

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基：北京路橋技術股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三吡啶基三嗪（tripyridine triazine，TPTZ）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、沒食子酸、檸檬酸、草酸、乳酸、DL-蘋果酸、奎寧酸、抗壞血酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖：上海易恩化學技術有限公司；碳酸鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、三氯化鋁、醋酸鉀、乙醇：天津市永大化學試劑有限公司；蘆丁、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；4-甲基-2-戊醇（4-methyl-2-pentanol，4M2P）：美國Sigma公司。乙腈和冰乙酸：津歐博凱化工有限公司；碳酸氫鈉（食品級）：市售。上述所有藥品均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

PB-21pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-50DA型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ZHJHC1214C型垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、TQ8040氣相色譜質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、AOC-20i Automatic Injector 自動進樣器：日本島津公司；InertSustain-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本GL Sciences公司；PDMS/DVB固相微萃取柱（65 μm）：美國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子發酵液的制備

植物乳桿菌ATCC14917凍干粉用0.2 mL的MRS液體培養基溶解混合均勻，吸取100 μL接種到3 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，連續活化2次，將所得菌液離心（4 000 r/min、10 min），收集細胞用無菌生理鹽水洗滌2次，然后重懸于無菌生理鹽水，作為發酵種子液。

1.3.2 沙棘發酵原漿的制備

使用1.0 mol/L NaHCO3溶液調節沙棘原漿pH至3.99，按5%的接種量接種上述發酵種子液，確保初始菌數達到1×107CFU/mL，37 ℃發酵72 h。每隔24 h取樣，樣品及時冷卻，并保存于-80 ℃，用于測定各指標。

1.3.3 微生物和pH的測定

活菌數的測定：參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準微生物學檢驗乳酸菌檢驗》；pH值的測定：pH計直接測定。

1.3.4 糖的測定

參照GB5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》的方法，采用示差折光檢測器，ZXBridge Amide色譜柱（3.5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫保持40 ℃，進樣量為10 μL；流動相為90%乙腈水∶0.1%氨水，流速為1.0 mL/min。

分別取果糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖和山梨醇用水配制成質量濃度20 mg/mL的標準溶液，稀釋至不同濃度進樣，根據濃度和相應峰面積得到標準曲線。準確移取1 mL發酵液至50 mL離心管，加10 mL水后，再依次加入2 mL硫酸鋅和2 mL亞鐵氰化鉀，渦旋1 min，用水定容至25 mL，10 000 r/min離心5 min后取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾后直接進樣。

1.3.5 有機酸的測定

參照文獻[10]的方法，略作修改。高效液相色譜條件：采用紫外檢測器，InertSustain-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量為20 μL，柱溫保持在30 ℃；流動相為0.05 mol/L KH2PO4溶液（用20%磷酸調為pH2.70），等度洗脫20 min，流速為0.6 mL/min。

取草酸、抗壞血酸、乳酸、奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸標準溶液用流動相稀釋至不同濃度的后分別進樣，根據濃度和相應峰面積得到有機酸標準曲線。將沙棘原漿用流動相稀釋10倍，然后用0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3.6 總黃酮的測定

參照DB43T 476—2009《植物源性食品中總黃酮的測定》。取蘆丁用水配制成不同濃度的標準溶液，各取1 mL依次加入2.0 mL三氯化鋁溶液（2.5 g/100 mL），2.0 mL醋酸鉀溶液（9.82 g/100 mL），混勻，體積分數30%的乙醇定容至50 mL，靜置15 min，以水為空白，于波長415 nm處測吸光度值，繪制蘆丁標準曲線。

發酵漿（4 000 r/min）離心10 min，移取1 mL上清液置于50 mL容量瓶中，同上操作，于波長415 nm處測吸光度值。總黃酮含量以蘆丁計。

1.3.7 總酚的測定

采用Folin-ciocalteu法[11]，將沒食子酸標準溶液稀釋至不同濃度，各取0.5 mL上述濃度的標液，加2.5 mL蒸餾水，再加入0.5 mL Folin-ciocalteu顯色劑和1.5 mL 7.5%Na2CO3溶液，混合均勻。室溫避光1 h后，于波長765 nm處測定吸光度值，以蒸餾水作為空白對照，繪制沒食子酸標準曲線。

將發酵漿4 000 r/min離心10 min，準確移取0.5 mL上清液，按照上述方法進行顯色反應，于波長765 nm處測定吸光度值。總酚含量以沒食子酸計。

1.3.8 抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力的測定：參照文獻[12]的方法；ABTS自由基清除能力測定：參照文獻[13]的方法；鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定：參照文獻[14]的方法。

1.3.9 揮發性成分的測定

固相微萃取：稱取樣液5 mL，加入2 g氯化鈉和1 μg/L 4-甲基-2-戊醇（4M2P）作為內標物，磁力攪拌，40℃水浴30min后，用固相微萃取柱（PDMS/DVB，65 μm）吸附30 min。

氣相色譜條件：采用SH-Rxi-5SilMS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min，1.5 ℃/min升溫至100 ℃，以4 ℃/min升溫至180 ℃保持1 min，15 ℃/min升溫至230 ℃保持3 min；進樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣（He），柱流量1 mL/min，采取不分流進樣。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲時間3 min，35～500 m/z進行質量掃描，采集方式Q3Scan。

自動進樣條件：萃取頭調節溫度250 ℃，萃取頭調節時間7 min，加熱溫度40 ℃，加熱時間30 min，攪拌器轉速：250 r/min，脫附時間3 min，其他參數默認。

通過匹配質譜數據庫美國國家標準與技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17及保留指數選擇匹配度＞80%的峰對各揮發性物質進行定性分析，采用內標法求取各揮發性成分含量并進行比較。

1.3.10 數據處理

運用Excel 2017整理數據及作圖，采用SPSS26.0軟件進行方差分析。每組試驗均重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌發酵沙棘原漿過程中活菌數和pH的變化

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，植物乳桿菌的活菌數和pH均顯著增加。發酵48 h和72 h時，活菌數分別為9.06 lg（CFU/mL）和9.21 lg（CFU/mL），兩者無顯著性差異（P＞0.05），說明植物乳桿菌發酵48 h即進入對數生長期。pH值持續升高，發酵72 h時從初始pH值3.99增加至4.21。說明植物乳桿菌具有利用沙棘原漿有機酸作為碳源進行發酵，從而降低沙棘原漿酸度的能力。

圖1 植物乳桿菌發酵沙棘原漿發酵過程中活菌數和pH值的變化Fig.1 Changes of viable bacteria counts and pH during the fermentation of sea buckthorn pulp by Lactobacillus plantarum

2.2 植物乳桿菌發酵沙棘原漿過程中糖和有機酸的變化

植物乳桿菌發酵沙棘原漿過程中糖和有機酸的變化見表1。

表1 植物乳桿菌發酵沙棘原漿發酵過程中糖和有機酸含量的變化Table 1 Changes of sugar and organic acids contents during the fermentation of sea buckthorn pulp by Lactobacillus plantarum mg/mL

由表1可知，沙棘原漿中的有機酸中奎寧酸和DL-蘋果酸含量最高，發酵72 h后，奎寧酸含量無顯著變化（P＞0.05），但DL-蘋果酸僅為3.94 mg/mL，降低了82.55%；另一個變化較大的是乳酸，由發酵前的6.18 mg/mL升至39.32 mg/mL，高于發酵72 h的奎寧酸含量（28.71 mg/mL）。說明植物乳桿菌ATCC 14917在沙棘原漿中進行了MLF，將蘋果酸轉化為乳酸。MLF是基于某些乳酸菌具有蘋果酸乳酸酶，可將蘋果酸脫羧為乳酸和二氧化碳，從而達到提高pH，降低酸度的目的[15]。

研究發現，蘋果酸轉化率受到果汁的種類和成分含量、菌種及發酵條件等因素的影響。本研究通過預試驗比較了幾株乳酸菌在本樣品的生長情況，篩選出植物乳桿菌ATCC 14917，其蘋果酸降解率低于某些文獻報道。如MARKKINEN N等[7]用4種乳酸菌分別發酵苦莓、越橘和沙棘3種果汁，蘋果酸降低了2.89%～100%，其中DSM 10492發酵沙棘的蘋果酸降解率達到100%。而TKACZ K等[8]分別用6株乳酸菌發酵沙棘汁和沙棘蘋果混合汁，發現混合汁的蘋果酸-乳酸轉化率最高，達到75.0%，而沙棘汁最高僅有20.79%，說明樣品的不同是影響蘋果酸降解率的一個重要因素。

MLF發酵中，檸檬酸含量降低58.59%，說明檸檬酸也能被植物乳桿菌利用。MOUSAVI Z E等[16]用植物乳桿菌發酵石榴汁，發酵48 h后果汁中檸檬酸含量由60 g/L降低至13 g/L，表明植物乳桿菌具有較強的檸檬酸代謝能力。檸檬酸裂解酶將檸檬酸裂解為乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸進一步脫羧為丙酮酸，形成雙乙酰、丙酮和丁二醇，有助于沙棘原漿香氣的豐富性[17]。

由表1亦可知，沙棘原漿樣品中僅檢測出葡萄糖和果糖2種單糖，發酵過程中，這2種單糖均呈現降低的趨勢；但降低幅度并不大，發酵72 h葡萄糖和果糖含量分別減少9.82%和10.09%。有研究表明，在低pH條件下，植物乳桿菌優先利用有機酸等非傳統碳源轉化為乳酸。MARKKINEN N等[7]的試驗也證明植物乳桿菌更偏好以酸作為碳源。

2.3 植物乳桿菌發酵沙棘原漿過程中總黃酮、總酚及抗氧化能力的變化

由表2可知，發酵后總酚含量顯著增加16.07%，發酵72 h達到650 mg/L；而總黃酮含量略有降低。主要是由于植物乳桿菌對沙棘原漿中的黃酮化合物代謝能力較低[18]。而發酵后總酚含量增加，與酶作用下相關化合物的轉化和解聚有關，說明植物乳桿菌在發酵過程中可產生相關酶，通過分解酚環上的羥基產生酚酸來增加總酚含量[19]。

表2 沙棘原漿發酵過程中總黃酮、總酚含量及抗氧化能力的變化Table 2 Changes of total flavonoids,total phenols contents and antioxidant capacity during the fermentation of sea buckthorn pulp

發酵后DPPH、ABTS自由基清除能力和FRAP分別顯著提高了5.26%、23.05%和13.93%。這可能與植物乳桿菌具有較強的還原鐵離子、清除自由基的能力有關[20]。LI T L等[21]分別用4種乳酸菌發酵紅棗汁，乳酸菌發酵顯著提高了棗汁總酚含量，以DPPH和FRAP法為基礎的抗氧化能力經發酵顯著提高。

2.4 植物乳桿菌發酵沙棘原漿過程中揮發性成分的變化

由表3可知，發酵前后共分離鑒定出73種揮發性化合物，其中發酵前共9類（包括酯類34種、醇類6種、烴類8種、酸類2種、醛類4種、酮類3種、酚類1種、雜環類2種和其他3種），發酵后共6類（包括酯類36種、醇類9種、烴類8種、酸類2種、酮類2種和其他1種）。由圖2可看出，發酵過程中，揮發性化合物的總量及類別均發生顯著性變化。發酵前的沙棘原漿以酯類、烴類和醛類為主，分別占揮發性物質總量的74.68%，6.31%和6.45%，發酵后以酯類和醇類為主，分別占揮發性物質總量的91.46%和7.39%。發酵后揮發性物質總量增加了4.67%，消失的13種風味物質以醛類、酚類、雜環類和其他類為主；新增的10種風味物質以酯類和醇類為主。

表3 植物乳桿菌發酵沙棘原漿發酵過程中揮發性成分的變化Table 3 Changes of volatile components during the fermentation of sea buckthorn pulp by Lactobacillus plantarum

續表

續表

圖2 植物乳桿菌發酵沙棘原漿發酵過程中揮發性主要物質變化Fig.2 Changes of main volatile substances during the fermentation of sea buckthorn pulp by Lactobacillus plantarum

酯類作為果漿中最重要的香氣物質，在沙棘原漿發酵前后均占總量的第一位。發酵后其總量提高了22.47%，表明植物乳桿菌發酵可以顯著提高沙棘果漿酯類的產量。MATTHEWS A等[22]發現60%來自南非葡萄和葡萄酒樣品的乳酸菌測試菌株具有酯酶編碼的基因，這些菌株可能參與酯的合成和水解，并有助于葡萄酒的香氣和風味。MLF產生大量中間體也為酯的形成提供了可能的前體，如乙酰輔酶A、醇和脂肪酸[23]。另外沙棘漿果的果皮中含有油脂，主要是三酰甘油，脂肪酸代謝也是酯類增加的一個重要來源。

沙棘原漿發酵過程中顯著增加的有2-甲基戊酸丙酯、己酸乙酯、異戊酸異戊酯、3-甲基丁酸-2-甲基丁酯和辛酸乙酯，分別增加1.86倍、2.09倍、1.55倍、1.83倍和1.66倍。MARKKINEN N等[24]采用植物乳桿菌發酵沙棘汁，GC-MS色譜中檢測出含量最高的化合物依次為3-甲基丁酸酯、3-甲基己酸丁酯和己酸乙酯。除了發酵因素，沙棘漿果揮發性成分的不同跟品種和生長條件也有直接的關系。酯類物質種類和含量變化是影響發酵漿品質和香氣的主要因素。這些酯類具有菠蘿、香蕉、蘋果等果香香氣，其中己酸乙酯除能賦予沙棘漿果香外還能帶來獨特的曲香。

發酵后，醇類總量增加125.54%，新增3種醇。LU Y Y等[25]研究發現，新增的醇可能是由氨基酸或己糖通過丙酮酸代謝形成的。1-壬醇和1-庚醇的增加顯著，分析是跟相應的醛類變化有關。本試驗發現發酵48 h后，沙棘原漿中4種醛類物質全部消失。MARKKINEN N等[24]用6株乳酸菌發酵沙棘汁發現，所有菌株發酵都降低了脂肪酸衍生醛的含量。醛類物質化學性質較活潑，且多為中間代謝物，通常不能穩定存在，容易被還原為相應的酸類和醇類[26]。本試驗原漿中的庚醛和壬醛在發酵過程中均消失，可能是植物乳桿菌發酵使其還原為庚醇和壬醇。庚醛和壬醛的消失，有助于降低果汁的焦糖味。而形成的醇類如壬醇具有玫瑰和橙子的宜人香氣，因此植物乳桿菌發酵后由醛譜向醇譜的變化有助于沙棘漿果香味的增加。

本試驗酸類僅有3種，其中乙酸在發酵24 h后增加，發酵72 h后消失。發酵初期乙酸含量增加，分析可能是植物乳桿菌激活了磷酸葡萄糖酸途徑的乙酸激酶途徑，植物乳桿菌在有氧條件下可以消耗乳酸，釋放等量的乙酸[26]，而發酵后期乙酸參與了酯類的形成。

發酵過程中，烴類含量顯著降低51.48%，這與蘋果酸參與烯烴代謝途徑有關[26]。沙棘漿的酚類物質僅檢測出一種，為2,4-二叔丁基苯酚，且在發酵過程中消失。2,4-二叔丁基苯酚常被作為抗氧化劑，推測可能在發酵過程中參與了抗氧化保護作用。

3 結論

植物乳桿菌ATCC 14917在沙棘原漿中生長情況較好，48 h進入對數生長期，活菌數達到9.06 lg（CFU/mL）；且表現出了良好的蘋果酸乳酸轉化能力，發酵72 h后，活菌數為9.21 lg（CFU/mL），沙棘原漿蘋果酸降低了82.55%，乳酸含量升高6.36倍，pH由3.99升至4.21。沙棘原漿發酵過程中總酚含量持續提高，發酵72 h達到650.00 mg/L；發酵后DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原/抗氧化能力均顯著提高。

采用GC-MS分析沙棘漿發酵前后的揮發性物質，發酵前后共檢測出73種香氣物質。發酵后，消失了13種風味物質，以醛類、酚類、雜環類和其他類為主；新增10種風味物質，以酯類和醇類為主。揮發性物質總量及酯類和醇類總量分別提高了4.67%、22.47%和125.54%。顯著增加的酯類和醇類主要有2-甲基戊酸丙酯、己酸乙酯、異戊酸異戊酯、3-甲基丁酸-2-甲基丁酯、辛酸乙酯、壬醇和庚醇，這些香氣物質賦予沙棘漿更濃郁的果香和花香。