大果山楂發酵液改善高脂飲食小鼠肥胖指標和腸道菌群多樣性

程天德，黃自通，葉秋瑩，游麗君，鐘 南

（1.清遠職業技術學院 食品藥品學院，廣東 清遠 511510；2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；3.華南農業大學 農業工程學院，廣東 廣州 510642）

肥胖癥是全球最普遍的健康問題之一，是導致死亡的主要風險因素[1]。肥胖與腸道菌群的結構及功能變化有關，越來越多的證據表明，腸道菌群在肥胖、肥胖相關炎癥和胰島素抵抗的發展中發揮著重要作用[2-3]，腸道菌群失調可導致肥胖及其并發癥的發生[4]。益生菌發酵的功能食品可以通過改善腸道菌群紊亂進而改善健康[5]，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGorbach-Goldin，LGG）是人類研究最廣泛的一種益生菌，具有平衡腸道菌群、改善腸道健康、增強腸粘膜屏障、預防和治療腹瀉、預防與促進過敏恢復、預防齲齒等功效[6-7]。

大果山楂（Malus domeri（Bois）Chev.）是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，在世界各地均有種植[8]。研究表明，大果山楂提取物可以有效預防或治療Ⅱ型糖尿病[9]，能夠通過誘導腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）磷酸化來降低葡萄糖的產生和甘油三酯的合成[10]，可以作為抗糖尿病和抗高脂血癥植物營養素因子的候選來源[11]。大果山楂中的多酚類化合物含量豐富，具有抗氧化、抑制自由基和降低高脂血癥的效果[12-13]。山楂果膠多酚能顯著降低高脂小鼠的肝臟質量、血清總膽固醇、肝臟甘油三酯、低密度脂蛋白和總脂質水平[14-15]，可以作為膳食補充劑用于預防脂肪肝和氧化損傷，在開發功能性食品方面具有很大潛力[16-17]。越來越多的研究表明，天然產物發酵制品可以通過調節腸道菌群改善肥胖及相關的代謝綜合癥[18-19]，但大果山楂發酵制品對腸道菌群的影響尚未見報道。大果山楂味道酸澀，不宜直接食用，益生菌發酵可有效改善大果山楂的澀味[20]。因此，本研究采用鼠李糖乳桿菌（LGG）發酵新鮮大果山楂所得的大果山楂發酵液來飼喂高脂小鼠，旨在探討其對高脂飲食小鼠肥胖指標及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂：采自廣東省連山縣某大果山楂種植基地。

小鼠：6周齡雄性C57BL/6小鼠體質量（20±2 g），飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供。小鼠被置于控溫和光照條件下（25 ℃，光照-暗循環12 h）飼養，自由獲取食物和水。

沒食子酸、兒茶素等標準品（純度均≥98%）：美國Sigma公司；表兒茶素、原花青素、咖啡酸、金絲桃苷、異槲皮苷、肉桂酸、綠原酸、根皮苷、熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸等標準品（純度均≥98%）：上海純晶生化科技有限公司；戊巴比妥鈉（批號：F20190816）、抗凝劑EDTA-K2：國藥集團上海化學試劑有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和肝甘油三酯（triglyceride，TG）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號：20190718）：南京建成生物工程研究所；糞便脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分離試劑盒：廣州IGE生物技術有限公司；MRS培養基、鼠李糖乳桿菌（LGG）CBS98073：廣東環凱微生物科技有限公司。

發酵培養基：大果山楂20%、葡萄糖5%、蛋白胨2%、酵母膏1%，自然pH值，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機：上海精密科學儀器有限公司；LDZF-50L-III高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；ZY-800發酵罐：上海紫裕生物科技有限公司；TGL-20M離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Waters1525高效液相色譜儀、二級陣列管檢測器、Waters2707自動進樣器、反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Waters公司；Illumina Miseq測序儀PE2500：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大果山楂發酵液制備的工藝流程及操作要點

大果山楂→洗凈→去核→打漿→調配→滅菌→接種→發酵→離心→滅菌→大果山楂發酵液

操作要點：將鼠李糖乳桿菌（LGG）CBS98073接入裝有MRS培養基的搖瓶中，于28 ℃培養7 d，然后按5×106CFU/mL接種至裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵，28 ℃、120 r/min發酵21 d。發酵結束后離心收集上清液于115 ℃滅菌20 min即得大果山楂發酵液，4 ℃貯存備用。

1.3.2 大果山楂發酵液中主要活性成分含量測定

參考溫玲蓉[21]的方法進行測定，采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法鑒定大果山楂發酵液中的主要活性成分，根據保留時間確定化合物種類，并對其主要化合物進行定量分析[22]。色譜條件如下：反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%三氟乙酸（A），甲醇（B）；流速1.00 mL/min；檢測波長280 nm、340 nm、217 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。實驗結果表示為大果山楂發酵液中所含的化合物含量（mg/L）。

1.3.3 動物試驗

32只6周齡雄性小鼠被隨機分為4組（對照組（ND）、高脂飲食組（HFD）、低濃度大果山楂發酵液組（HFD+LFB）、高濃度大果山楂發酵液組（HFD+HFB）），每組8只。對照組（ND）和高脂飲食組（HFD）分別允許自由進食正常飲食和高脂飼料，灌胃生理鹽水；低濃度大果山楂發酵液組（HFD+LFB）自由進食高脂飼料，灌胃低濃度大果山楂發酵液；高濃度大果山楂發酵液組（HFD+HFB）自由進食高脂飼料，灌胃高濃度大果山楂發酵液。處理12周后所有小鼠經歷12 h禁食后測定體質量，采用1%戊巴比妥鈉（50 mg/（kg·體質量））對小鼠進行深度麻醉后處死。動物實驗經廣州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（2019-083）。小鼠飲食成分見表1。

表1 小鼠飲食成分Table 1 Dietary components of mice

1.3.4 肝臟指數和內臟脂肪指數測定[23]

處死小鼠后，分離肝臟和內臟脂肪并分別稱質量，按下式計算肝臟指數與內臟脂肪指數：

1.3.5 組織學分析

解剖小鼠后，取出肝臟浸于-80 ℃液氮中保存，在低溫條件下送往武漢塞維爾生物科技有限公司進行油紅O（切片）染色。

1.3.6 生化分析

解剖小鼠后，經腹主動脈取出全血，置于含抗凝劑EDTA-K2的小試管中。血樣于4 ℃、4 000 r/min離心10 min后取上清液，采用ELISA試劑盒測定血漿總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和肝甘油三酯（TG）。

1.3.7 腸道菌群分析

小鼠飼養12周后，采集糞便標本進行16S rRNA基因測序。首先利用糞便DNA分離試劑盒提取糞便DNA，然后用特異性引物對16S rRNA基因的V4區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，純化PCR產物至相同的DNA濃度，使用Illumina Miseq測序儀PE2500進行測序，基于相似度99%對所有樣品的全部non_chimeras序列聚類（聚類軟件為Qiime調用Uclust），將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），去除所有樣本中只出現一次的OTUs。利用GreenGene數據庫通過核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）Classifier（Version 2.2）對每個OTU進行物種注釋confidence cutoff 0.8，同時基于各個樣本在不同分類水平上的物種組成及豐度信息進行統計匯總。

1.3.8 統計分析

采用GraphPad Prism 7.0版軟件對數據進行統計分析，數據以“平均值±標準差”表示，多組間差異比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果與分析

2.1 大果山楂發酵液中的主要活性成分

大果山楂發酵液中的主要活性成分含量見表2。由表2可知，大果山楂發酵液中主要含有多酚類（咖啡酸、肉桂酸、綠原酸）、黃酮類（表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、木樨草素、根皮苷和根皮素-2'-木糖苷）和叁萜類（山楂酸、熊果酸、齊墩果酸和科羅索酸）化合物，其中多酚類和黃酮類物質與腸道菌群調節、改善肥胖及其并發癥密切相關[24]。

表2 山楂發酵液中的主要活性成分含量Table 2 Content of main active components in fermented hawthorn broth

2.2 大果山楂發酵液對高脂飲食小鼠體質量和脂肪積累量的影響

由圖1（A）可知，與ND組相比，HFD組小鼠體質量增加極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食導致了小鼠肥胖；與HFD組相比，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠體質量均出現下降，但HFD+LFB組小鼠體質量下降不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組小鼠體質量下降顯著（P＜0.05），說明大果山楂發酵液可以抑制由高脂飲食導致的肥胖，且這種抑制作用與大果山楂發酵液的攝入量有關。

圖1 山楂發酵液對高脂飲食小鼠體質量和脂肪積累量的影響Fig.1 Effects of fermented hawthorn broth on body mass and fat accumulation of high-fat diet mice

內臟脂肪指數是反映動物肥胖程度的重要指標[25]，由圖1（B）可知，與ND組相比，HFD組小鼠內臟脂肪指數增加極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食會促進脂肪在小鼠體內堆積；與HFD組相比，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠內臟脂肪指數均出現下降，但HFD+LFB組小鼠內臟脂肪指數下降不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組小鼠內臟脂肪指數顯著下降（P＜0.05），說明大果山楂發酵液能抑制小鼠體內脂肪的積累。

肝臟指數是反映動物肝臟質量隨體質量變化的常用指標[26]，由圖1（C）可知，各組小鼠的肝臟指數差異均不顯著（P＞0.05），說明高脂飼料和大果山楂發酵液的攝入并未明顯促進小鼠肝臟指數的改變，這與相關報道不一致[27]。

由圖1（D）可知，各組小鼠的肝細胞形態基本正常，與ND組相比，HFD組小鼠肝臟組織油紅O染色面積明顯增大，說明高脂飲食會導致小鼠肝臟脂肪數目增多；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠肝臟組織油紅O染色面積明顯減小，較為稀疏，說明大果山楂發酵液的攝入減緩了小鼠肝細胞中脂肪的堆積。

2.3 大果山楂發酵液對高脂飲食小鼠血脂含量的影響

由圖2可知，與ND組相比，HFD組小鼠出現高血脂癥狀，高密度脂蛋白（HDL）濃度顯著下降（P＜0.05）（圖2C），總膽固醇（TC）（圖2A）、肝甘油三酯（TG）（圖2B）和低密度脂蛋白（LDL）（圖2D）濃度均有不同程度的上升，其中TG濃度上升極顯著（P＜0.01），TC濃度上升顯著（P＜0.05），LDL濃度上升但不顯著（P＞0.05），說明高脂飲食小鼠肥胖模型比較成功。經過大果山楂發酵液干預后，各組小鼠的高血脂癥狀均有不同程度的減輕，與HFD組相比，HDL濃度上升，TG、TC和LDL濃度均有不同程度的下降，由圖2（B）可以看出，HFD+HFB組的TG濃度相對HFD組顯著降低（P＜0.05），說明大果山楂發酵液可改善由高脂飲食造成的血脂升高現象。

圖2 山楂發酵液對高脂飲食小鼠血脂含量的影響Fig.2 Effect of fermented hawthorn broth on blood lipid content in high-fat diet mice

2.4 大果山楂發酵液對高脂飲食小鼠腸道菌群豐度和多樣性的影響

從各分類層級獲得注釋OTUs數量統計結果（圖3A）可以看出，與ND組比較，HFD組小鼠腸道菌群豐度明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食會顯著降低小鼠腸道菌群的豐富度，這與相關報道結果一致[28]；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道菌群豐度均有不同程度的上升，但HFD+LFB組上升不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組上升極顯著（P＜0.01），說明大果山楂發酵液的干預可以逆轉由高脂飲食導致的小鼠腸道菌群豐度降低，且這種效應與大果山楂發酵液的攝入量呈正相關。Alpha多樣性分析可用于分析樣品內群落的豐富度和均勻度，Chao1指數是Alpha多樣性分析中最常用的指標之一，Chao1指數越大，說明樣品中的物種越豐富[29]，物種豐富度相同的情況下，菌落中各物種均勻度越大，菌落多樣性越大[30]。從圖3B可知，與ND組比較，HFD組的Chao1指數出現下降；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組的Chao1指數出現回升，而且HFD+HFB組與HFD組有顯著性差異（P＜0.05），說明高脂飲食會降低小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度，大果山楂發酵液可逆轉這種現象，而且這種逆轉能力與大果山楂發酵液攝入量正相關。從各樣品對應的物種注釋結果在門水平上的相對豐度柱形圖（圖3C）可以看出，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是小鼠腸道中的優勢菌群，這與相關報道結果一致[31]。高脂飲食和大果山楂發酵液的干預改變了小鼠腸道菌群的結構，與ND組比較，HFD組小鼠腸道Bacteroidetes（B）的相對豐度下降，Firmicutes（F）的相對豐度上升，F/B值上升；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道Bacteroidetes的相對豐度上升，Firmicutes的相對豐度下降，F/B值降低，說明高脂飲食導致了小鼠腸道菌群失調，大果山楂發酵液可以調節高脂飲食導致的肥胖小鼠腸道菌群在門水平上的組成，且這種調節能力與大果山楂發酵液的攝入量正相關。

圖3 山楂發酵液對高脂飲食小鼠腸道菌群豐度和多樣性的影響Fig.3 Effects of fermented hawthorn broth on the abundance and diversity of intestinal flora in high-fat diet mice

2.5 大果山楂發酵液對高脂飲食小鼠腸道特定菌群的影響

進一步分析了各組小鼠腸道菌群在屬和種水平上的差異菌，在屬水平上各組小鼠腸道菌群能夠注釋到的物種主要包括薩特菌（Sutterella）、Flexispira、普雷沃氏菌（Prevotella）、副擬桿菌（Parabacteroides）等，在種水平上各組小鼠腸道菌群能夠注釋到的物種主要包括隱藏梭菌（Clostridium celatum）、類腐敗梭菌（Clostridium paraputrificum）、高山姬鼠螺桿菌（Helicobacter apodemus）和產酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）等。由圖4可知，與ND組相比，HFD組小鼠腸道的Sutterella、Flexispira、Clostridiumcelatum、Clostridium paraputrificum和Helicobacter apodemus相對豐度升高，Prevotella、Parabacteroides和Bacteroides acidifaciens的相對豐度降低；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道的Sutterella、Flexispira、Clostridium celatum、Clostridium paraputrificum和Helicobacter apodemus相對豐度降低，Prevotella、Parabacteroides和Bacteroides acidifaciens的相對豐度升高。高脂飲食改變了小鼠腸道菌群的結構，大果山楂發酵液干預增加了高脂飲食小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，特別是與肥胖及免疫調節相關的菌群，其中Sutterella是短鏈脂肪酸的主要生產微生物，短鏈脂肪酸是結腸上皮細胞營養的主要來源，具有抗炎和調節腸道免疫等作用[32]，Parabacteroides具有改善炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、非酒精性脂肪肝和肥胖的作用[33]，Prevotella可以通過影響腸道通透性來調節宿主機體免疫力[34]，腸道內Bacteroides相對豐度升高可能通過介導炎癥效應參與胰島素抵抗、肥胖等疾病的發生[35]，Bacteroides acidifaciens可能具有治療糖尿病和肥胖癥等代謝性疾病的潛力[36]。結合大果山楂發酵液中主要活性成分檢測結果和肥胖指標檢測結果，推測大果山楂發酵液中的黃酮類、多酚類等化合物可能通過調節小鼠腸道中的上述菌群豐度抑制由高脂飲食導致的脂肪堆積，進而改善血脂異常。

圖4 山楂發酵液對高脂飲食小鼠腸道特定菌群的影響Fig.4 Effects of fermented hawthorn broth on specific intestinal flora of high-fat diet mice

3 結論

通過研究大果山楂發酵液對高脂飲食誘導小鼠肥胖指標及腸道菌群的調節作用，結果表明，攝入大果山楂發酵液可以抑制小鼠體質量的增加，促進肥胖小鼠的脂肪積累量和血脂水平向正常化恢復，從而降低肥胖的風險；大果山楂發酵液還可以顯著提升高脂小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，在門水平上提升高脂小鼠腸道擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度，降低厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度，從而降低F/B值，改善高脂小鼠腸道菌群失調；在屬和種水平上通過調節特定菌群（如Sutterella、Flexispira、Prevotella、Parabacteroides、Clostridium celatum、Clostridium paraputrificum、Helicobacter apodemus和Bacteroides acidifaciens等）的相對豐度使高脂小鼠的腸道菌群向正常化轉變，調節腸道屏障，改善肥胖引起的代謝紊亂。因此，大果山楂發酵液在腸道菌群的調節中呈現良好的益生作用，可作為功能性食品成分預防腸道微生態失調，通過調節腸道菌群的結構實現減脂的目的。