常壓室溫等離子體誘變選育耐酸釀酒酵母菌株

耿海波，鄭 輝，張麗媛，郭會燦，李浩楠，張世佳，安麗平

（1.石家莊職業技術學院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081；2.河北中醫學院 基礎醫學院，河北 石家莊 050200）

在果酒發酵過程中，釀酒酵母能將原料中的糖轉化為酒精，并在揮發性代謝物的合成中起著重要的作用，其產生的成分包括酯類、高級醇類、揮發性酸類、萜烯類、苯衍生物和硫化合物等，是影響果酒感官特性的主要因素[1-2]。鑒于釀酒酵母在果酒生產中的重要性，人們一直在努力獲得優良的釀酒酵母菌株。但是釀酒酵母工業化應用中不可避免要面臨的問題是菌種在生產過程中對酸性環境的適應能力[3]。研究表明，pH值在調節微生物的生長和代謝方面應發揮關鍵作用，低pH環境可誘導酵母細胞脫水、質壁分離，甚至細胞失活，還會導致果酒酸澀、口感較差[4]。一般來說，釀酒酵母的最適pH值在3.8～6.0之間，部分經選育后用于果酒發酵的菌株可以耐受pH值為3.2[5]。但是，果酒在生產時pH值往往低于3.0，較低的pH環境嚴重抑制了微生物的活性，可能導致發酵時間延長，口感變差，最終影響果酒的整體品質[6]。因此，獲得對酸性有較強耐受力的釀酒酵母菌株成為優化果酒生產的有效方法[7-8]。

目前，通過轉基因方法可以提高釀酒酵母對酸性環境的耐受性，但是轉基因技術涉及到生物安全性和消費者接受度的問題，尚無法滿足果酒的工業化生產需求[9-10]，因此，操作簡單、成本較低、適用范圍廣的傳統誘變技術仍是釀酒酵母育種研究和產業應用廣泛采用的方法[11-13]。但反復采用單一誘變方法會使得菌種產生疲勞效應，如導致生物量降低、產物含量減少等問題。因此，采用安全高效的誘變技術成為近年來研究的熱點[14]。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasmas，ARTP）誘變技術因設備結構簡單、成本低、安全性高、突變譜廣和突變率高等特點，近年來在工業微生物育種中發揮著重要的作用[15]。ARTP技術成功應用的對象包括細菌、真菌和微藻等，經過誘變后菌種的生長、生產能力以及耐受力等方面均得以改善[16-18]。

本研究從實驗室保藏的釀酒酵母中篩選出具有耐酸基礎的菌株SC-62作為誘變出發菌株，通過ARTP誘變技術對其進行誘變處理，篩選耐酸釀酒酵母高產正突變株，以期為釀造研究乃至工業化生產提供有價值的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC-62：本實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基

所用培養基均按參考文獻進行配制：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[19]，WL營養瓊脂（wallerstein laboratorynutrientagar，WL）培養基[20]，氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培養基[21]，酸性發酵培養基[22]。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、乳酸、KH2PO4、KCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4·7H2O、MnSO4、NaCl、瓊脂粉、無水乙醇、TTC：國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚綠：上海源葉生物科技有限公司；氨芐青霉素：北京索萊寶科技有限公司。以上所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

ARTP-II 型ARTP 等離子體誘變儀：北京思清源生物科技有限公司；YJ-VS-1型單人垂直超凈工作臺：無錫一凈凈化設備有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DHP-9602型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養箱：常州恒隆儀器有限公司；UV-1900i型紫外-可見分光光度計：島津企業管理（中國）有限公司；PAL-1型糖度儀：廣州市愛宕科學儀器有限公司；A8964型酒精計：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ME204型電子分析天平、FE22型pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

挑取實驗室保藏的釀酒酵母出發菌株SC-62，接種到YPD斜面培養基上，于28 ℃恒溫培養24 h后，挑取單菌落接種到YPD液體培養基中，于28 ℃靜置培養24 h，再將上述菌液按2%（V/V）的接種量接種到YPD液體培養基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養至對數生長期，使菌株得以充分活化后，置于離心機中6 000 r/min離心10 min后收集菌體，用生理鹽水洗滌三遍，重懸浮，用生理鹽水調節菌體濃度為1×108個/mL。

1.3.2 釀酒酵母菌株SC-62生長曲線的測定[21]

將活化后的上述菌懸液按5%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養基中，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養，每組平行做3份，每隔2 h取樣測定菌液的OD600nm值，以培養時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 ARTP誘變

固定ARTP等離子體誘變儀的工作條件，將誘變時間作為誘變變量對菌液進行誘變處理。具體處理步驟為：取10 μL菌懸液于直徑5 mm的無菌不銹鋼載片上，以純度為99.999%的氦氣（He）為注入氣體，流速選擇QHe=10.0 L/min，電源功率選擇120W，處理距離2mm，處理溫度低于40℃[23-24]。出發菌株分別在ARTP儀下誘變處理0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，每次誘變結束后將不銹鋼載片置于含990 μL無菌生理鹽水的EP管中，在漩渦器上振蕩洗滌1 min，將誘變菌洗脫下來。分別對上述菌液進行梯度稀釋至菌體濃度為103～104個/mL，吸取0.1 mL稀釋液涂布到YPD固體培養基平板，28 ℃于恒溫培養箱中倒置培養48 h后，觀察并記錄菌落數量，按公式計算致死率，繪制致死曲線并確定最佳誘變處理時間，在最佳誘變條件下對出發菌株進行誘變，經培養后挑取單菌落進行性能鑒定。菌株致死率計算公式如下：

式中：Z表示菌株的致死率，%；X1為誘變處理后的菌落數，個；A為對照組的菌落數，個。

1.3.4 菌株耐酸、產酒精、產氣性能初篩

耐酸性菌株篩選：向YPD液體培養基加入乳酸調節pH值至2，按5%（V/V）的接種量接入誘變菌株，于28 ℃、160 r/min振蕩培養48 h后，用接種環在WL固體培養基表面劃線接種，于28 ℃恒溫培養24 h，挑取生長較好的單菌落，接種到YPD固體斜面培養[22]。

TTC顯色法篩選[25-26]：用接種環挑取上步篩選的菌株在TTC下層培養基表面劃線接種，于28 ℃培養48 h，將TTC上層培養基倒入TTC下層培養基表面，于28 ℃培養3 h后，觀察培養基顯色情況，從中篩選出產酒精能力較強的菌株。

杜氏小管發酵法篩選[27]：取0.5 mL菌懸液于10 mL YPD液體培養基的試管中，倒置裝入杜氏小管，管口密封后于28 ℃靜置培養，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內產氣情況，篩選出生長和發酵性能較好的菌株。

1.3.5 菌株發酵性能復篩

將出發菌株SC-62與初篩得到的菌株分別按照5%（V/V）的接種量接種到pH為2.5的酸性發酵培養基中，于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養箱中發酵6 d，每24 h測定一次發酵液CO2質量損失，發酵結束后，分別測定發酵醪液中的發酵力、總糖、酒精度、總酸、揮發酸和pH。

1.3.6 菌株耐受性能測定

乙醇耐受性測定：分別在YPD液體培養基中加入體積分數6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的無水乙醇，按5%（V/V）的接種量將菌株接種于YPD液體培養基中，培養48 h后測定生長情況。

鹽耐受性能測定[29]：分別配制NaCl含量為10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L的YPD液體培養基，將菌株按5%（V/V）的接種量接種后培養7 d，觀察菌株生長情況。

糖耐受性能測定[29]：分別配制葡萄糖含量為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L的YPD培養基，按5%（V/V）的接種量接種后培養7 d，觀察菌株生長情況。

1.3.7 遺傳穩定性試驗

將篩選出的菌株連續傳代培養5次，并將每代培養的菌株按照5%（V/V）的接種量分別接種到pH為2.5的酸性發酵培養基中，于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養箱中發酵6 d，測定每代菌株的產酒精能力，從而驗證菌株耐酸性和產酒精能力的遺傳穩定性[22]。

1.3.8 測定方法[22，28]

發酵力：杜氏管發酵法；總糖：菲林試劑法；酒精度：密度瓶法；總酸（以酒石酸計）：氫氧化鈉溶液滴定法；揮發酸（以乙酸計）：水蒸氣蒸餾滴定法；pH值：采用pH計對發酵液的pH值進行測定。

1.3.9 數據分析

采用Excel 2019對數據進行整理和作圖，用SPSS 26.0軟件對數據進行方差分析。每組實驗平行三份，數據結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定結果

菌株的生長狀態會在很大程度上影響誘變的效果，處于對數期的酵母菌形態特征、成分組成和生理特性趨于一致，對環境因素的影響較為敏感，因此選擇菌株的對數生長期進行誘變可達到較好的誘變效果[27]。經測定后繪制釀酒酵母出發菌株SC-62的生長曲線，由圖1可知，菌株SC-62在培養0～10 h時生長速度較慢，處于延滯期；在培養10～20 h時進入生長對數期，之后進入穩定期。因此，通過對生長曲線數據分析后選擇對數期的中期，即培養16 h時對菌株進行誘變。

圖1 釀酒酵母菌株SC-62的生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae strain SC-62

2.2 最佳誘變時間的確定

一般而言，在誘變育種時，突變率會隨著誘變劑量的增大而增加，但是達到一定誘變劑量后，再加大劑量會導致死亡率過高、誘變效率下降。為了獲得最佳的誘變效果，以誘變時間作為變量，對酵母菌誘變處理后的死亡率作致死曲線，結果見圖2。

圖2 誘變時間對釀酒酵母菌株SC-62致死率的影響Fig.2 Effect of mutation time on the lethality of Saccharomyces cerevisiae strain SC-62

由圖2可知，隨著誘變時間的延長，菌株致死率迅速增加，一般選擇菌株致死率在80%～90%范圍內對菌株進行誘變效果較好。當誘變時間為80 s時，菌株致死率為84.0%，因此本實驗選擇80 s為誘變處理的最佳時間。對出發菌株進行誘變（平行3次），培養后挑取生長較好的165個單菌落，移種到斜面培養并加以篩選。

2.3 菌株耐酸、產酒精、產氣性能初篩結果

2.3.1 耐酸性能的測定結果

由表1可知，165株釀酒酵母中篩選出6株耐酸性能較好的菌株，分別為菌株A-18、A-41、A-73、A-96、A-107、A-135。

表1 釀酒酵母菌株耐酸性能測定結果Table 1 Determination results of acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.3.2 產酒精能力的測定結果

由表2可知，6株釀酒酵母菌株中產酒精能力相對較強的是菌株A-18、A-73、A-107和A-135。

表2 釀酒酵母菌株產酒精能力測定結果Table 2 Determination results of alcohol production capacity of Saccharomyces cerevisiae strains

2.3.3 產氣能力的測定結果

由表3可知，菌株A-73、A-107和A-135的產氣能力相對較強，在培養至24 h時杜氏小管中已充有1/2的CO2氣體，在培養至36 h時杜氏小管中已經充滿CO2氣體。

表3 釀酒酵母菌株產氣能力測定結果Table 3 Determination results of gas production capacity of Saccharomyces cerevisiae strains

綜合菌株耐酸、產酒精能力、產氣能力的測定結果，選擇菌株A-73、A-107和A-135進行發酵性能復篩。

2.4 菌株發酵性能復篩結果

將出發菌株SC-62和初篩得到的菌株A-73、A-107和A-135在酸性發酵液中培養后測定其發酵參數，結果見表4。

由表4可知，3株突變菌株與出發菌株SC-62發酵后的結果相比，不論發酵力還是產酒精能力均出現了不同程度的增加，其中菌株A-107增加顯著，與出發菌株SC-62相比，其發酵力[6.21 g CO2/（100 mL·24 h）]提高了37%，酒精度（11.52%vol）提高了30%，同時總糖比其他菌株更低（3.85g/L），說明菌株A-107能高效的利用培養基中的糖轉化為產物酒精，發酵后pH（2.39）較其他菌株低，對酸性發酵環境具有更強的適應能力，其產生的揮發酸含量（0.69 g/L）也低于國標GB 15037—2006《葡萄酒》中規定的葡萄酒中揮發酸含量≤1.2 g/L的限值，整體發酵性能優于其他突變株。

表4 釀酒酵母菌株發酵性能測定結果Table 4 Determination results of fermentation performance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.5 菌株耐受性能測定結果

對出發菌株SC-62與初篩得到的菌株A-73、A-107和A-135的乙醇耐受性、NaCl耐受性和葡萄糖耐受性等指標進行測定，結果見表5。

表5 釀酒酵母菌株耐受性能測定結果Table 5 Determination results of tolerance performance of Saccharomyces cerevisiae strains

從表5可知，4株釀酒酵母均可耐受12%乙醇、100 g/L的NaCl、500 g/L的葡萄糖，其中菌株A-107對乙醇表現出更強的耐受性，可耐受16%乙醇。再綜合初篩復篩測定結果，菌株A-107在發酵性能和耐受性能等方面優于其他菌株，故選擇此菌株進行進一步測定，考察其遺傳穩定性。

2.6 菌株遺傳穩定性測定結果

將篩選出的菌株A-107在酸性發酵培養基中連續5次傳代培養，測定其產酒精能力，結果見圖3。

圖3 菌株A-107遺傳穩定性測定結果Fig.3 Determination results of genetic stability of strain A-107

由圖3可知，將菌株A-107連續傳代5次后，在酸性發酵培養基中仍能保持穩定的生產能力。產酒精能力最強的是第二代11.56%vol，最低的為第四代11.29%vol，總體而言，五代之間產酒精能力無明顯變化（P＞0.05），說明突變菌株的耐酸性能和產酒精性能遺傳穩定性高。

3 結論

本研究以實驗室保藏的具有一定耐酸能力的釀酒酵母菌株SC-62為出發菌株，采用ARTP誘變技術對菌株進行誘變處理后獲得165株釀酒酵母菌株，通過耐酸測定、TTC顯色法、杜氏小管發酵法初篩出三株耐酸性、產酒精和產氣性能較好的菌株后，進行發酵性能復篩，并測定其耐受性能和遺傳穩定性。最終獲得一株正突變的釀酒酵母菌株A-107，其發酵力6.21 g CO2/（100 mL·24 h）和酒精產量（11.52%vol）相比出發菌株SC-62分別提高了37%和30%，可耐受乙醇體積分數16%、NaCl 100 g/L、葡萄糖500 g/L，遺傳穩定性好，具有一定工業應用潛力。