乳酸菌發酵紅茶飲料主要營養成分變化

馮雪娜，李 嘯，2*，李建華，談亞麗，王慶宇，王帥靜

（1.三峽大學 生物與制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；3.安琪生物集團有限公司，湖北 宜昌 443003）

乳酸菌是一類對人體健康有益的活性微生物，可以通過調節宿主免疫系統功能和改善微生態平衡，達到提高宿主健康水平和健康狀態的作用[1-2]。它們可以直接作為食品添加劑使用，用來改善腸道營養和維持腸道菌群的平衡[3-4]。茶是我國的傳統飲料，茶葉中含有茶多酚等許多生理活性物質，賦予茶葉降血壓、降血脂、防輻射、抗衰老等功效[5-7]，是人們日常生活中理想的保健飲品。發酵茶飲料是指以茶水為主要基質，利用微生物的代謝作用使茶水發生深度的生理生化反應，從而使茶水的生化成分和外形發生改變[8-9]。這種通過微生物發酵制得的茶飲料不但可以保留茶葉本身的飲用價值，還可以帶入許多微生物代謝活性物質，從而增加茶飲料的附加價值，豐富茶產品類型[10]。

目前，國內外已經有諸多利用益生菌發酵開發功能性茶飲料的報道，如CHO Y H等[11-12]開發的乳酸菌發酵飲料，具有蛋白質、脂肪含量低，感官性狀良好等特性；劉佳奇等[12]利用植物乳桿菌發酵鐵觀音制得乳酸菌烏龍茶飲料，飲料成品口感醇厚，兼具茶香和乳香；陳萬更[13]以枸杞、綠茶為原料，用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發酵菌株生產出了枸杞綠茶乳酸發酵飲料，但當前研究主要集中在混菌發酵，也多以綠茶為發酵基質，而針對乳酸菌單菌種發酵紅茶的工藝探索鮮見報道。因此，積極開發利用乳酸菌發酵紅茶飲料，將會為乳酸菌的利用和茶葉的深加工提供理論基礎，豐富乳酸菌飲料的品質，促進茶葉的綜合利用，推動茶葉市場的發展。

該實驗以紅茶浸提液為發酵基質，接種植物乳桿菌種子液后進行發酵，分析乳酸菌紅茶飲料發酵過程中基質紅茶浸提液的pH值、酸度、氨基酸總量、茶多酚含量，以及采用分光光度法分析氨基酸種類的發酵前后的差異，并使用頂空固相微萃取法（head space solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜法（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）結合較全面地分析比較紅茶發酵前后揮發性香氣成分的差異，旨在為乳酸菌發酵紅茶飲料的研究奠定科學基礎，為后續的規模化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶葉：湖北五峰采花茶業科技園；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）B2：安琪酵母菌種保藏中心；蔗糖（食品級）：市售；酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、茚三酮、谷氨酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

MRS液體培養基[14]：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸銨2.0g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1.0 g/L。將pH調至6.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZQZY-98CV振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；XCS-HJSG-3定制型恒溫攪拌三聯水浴鍋：陜西鑫昌實驗儀器設備有限公司；WG-0.25JDF脈動真空滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀、DB-HeavyWax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS（57328-U）萃取頭：美國Supelco公司；FE28 pH計、ME3002電子天平、AB104-N分析天平：梅特勒-托利多集團；UV-2102C可見光分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的植物乳桿菌B2接入裝液量為20 mL/250mL MRS液體培養基中，置于振蕩培養箱中32℃、180 r/min培養24 h，完成初次復壯。再將初次復壯后的菌液接入裝液量為45 mL/500 mL MRS液體培養基中，置于振蕩培養箱中32 ℃、180 r/min培養12 h制成種子液，備用。

1.3.2 乳酸菌紅茶飲料的加工工藝流程及操作要點

紅茶茶葉→浸提→過濾→濾液→調配（蔗糖）→滅菌→冷卻→接種→發酵→離心→上清液→無菌灌裝→成品

操作要點：將紅茶與蒸餾水比為8∶1 000（g∶mL）的混合液體置于85 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min后，用4層紗布濾去茶渣，然后向濾液中加入100 g/L的蔗糖，混勻后分裝至250 mL錐形瓶中，每瓶裝液量為150 mL。用透氣封口膜包扎后進行高溫滅菌（121 ℃、20 min）。滅菌結束冷卻至室溫備用，即制成發酵培養基。發酵培養基中接入6%（V/V）植物乳桿菌B2的種子液。于36 ℃培養箱中靜置發酵5 d，每隔1 d取樣一次，將樣品5 000 r/min離心5 min制得上清液，用于相關指標的檢測。直至pH值趨于平穩，取樣結束。同時以未接種的原紅茶浸提液作為對照組。

1.3.3 測定方法

pH值：采用酸度計直接測定；蔗糖含量：參照文獻[15]采用生物傳感器測定；茶多酚含量：參照文獻[16]采用酒石酸亞鐵法測定；總酸（以乳酸計）：參照文獻[17]采用酸堿滴定法；游離氨基酸總量及組分：參照文獻[18]采用茚三酮比色法測定。

揮發性香氣成分含量的檢測方法：參照文獻[19]采用HS-SPME/GC-MS聯用法。

稱量樣品至頂空瓶中，用帶有硅橡膠墊的瓶蓋密封，放入旋轉振蕩器中，在水浴50℃中平衡30 min；用DVB/CAR/PDMS復合萃取頭插入樣品瓶頂空部分吸附30 min后；將吸附好的萃取頭取出快速插入氣相色譜儀進樣口，在250 ℃條件下解吸5 min。

氣相色譜條件：采用DB-Heavy WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He）（純度＞99.999%）；色譜柱升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升至200 ℃，再以10 ℃/min的速度升至250 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃，進樣方式：不分流。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃；掃描質量范圍20～450 amu。

定性分析：使用Agilent Mass Hunter完成實驗數據的采集和分析，并結合CAS號及配比度對化合物進行定性。

定量分析：通過峰面積歸一化法，即計算出各組分峰面積占總峰面積的百分比就是各組分的相對含量。

1.3.4 數據處理

每個實驗均重復3次，數據采用Microsoft Excel 2019、Origin 9.0進行處理及繪圖，采用SPSS（Version 17.0）進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌紅茶飲料發酵過程中pH值、總酸、蔗糖含量的變化

由圖1可知，在乳酸菌紅茶飲料發酵過程中，pH值、總酸與蔗糖含量在前3天均發生了明顯的變化，之后趨于穩定。其中pH值由4.97降至3.16；總酸由0.15 g/L升至2.38 g/L；蔗糖含量由0.90 g/L降至0.34 g/L。這可能與乳酸菌發酵利用蔗糖產生酸有關，導致總酸含量增加，pH值降低，蔗糖濃度減少。同時可知，乳酸菌發酵主要在前3 d完成，酸度增高，耗糖量大，代謝活動旺盛；第3天后發酵過程逐步趨于平穩，主要成分變化不明顯。

圖1 乳酸菌紅茶飲料發酵過程中總酸、pH值與蔗糖含量的變化趨勢Fig.1 Variation trend of total acid,pH and sucrose content during the fermentation of black tea beverage with lactic acid bacterium

2.2 發酵過程中茶多酚含量的變化

茶多酚是一類存在于茶葉中多種不同酚類及其衍生物的總稱，其含量的高低關乎茶葉品質的好壞[20]。在發酵過程中茶多酚含量的變化如圖2所示，在發酵前期，茶多酚含量大量減少，后期減少的趨于平緩，總體上茶多酚含量由最初的15 100 mg/L減少至10 600 mg/L，其質量分數的降低有利于減少茶湯苦澀的口感，有益于茶葉品質茶飲料風味的提升。綜合茶多酚含量的變化可得，茶多酚含量減少幅度小，使發酵后茶湯的酚氨比有所降低，有助于形成茶湯鮮爽的口感，因此發酵后的茶湯更有豐富的營養和新鮮的口感[21]。

圖2 乳酸菌紅茶飲料發酵過程中茶多酚的變化趨勢Fig.2 Variation trend of total tea polyphenols contents during the fermentation of black tea beverage with lactic acid bacterium

2.3 紅茶浸提液發酵前后游離氨基酸種類的變化

茶葉中氨基酸的組成成分與茶葉的風味品質、香氣及滋味的關系密切，氨基酸的種類、含量以及它們的轉化產物或降解產物都直接或間接影響了茶葉的品質，它們不僅是組成蛋白質的基本單位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要組成成分[22]。因此，它們也是構成茶葉品質的重要成分之一。紅茶浸提液發酵前后游離氨基酸組分的變化差異見表1。

由表1可知，原茶湯中茶氨酸占游離氨基酸總量的78.2%，是茶葉中氨基酸的主要組成成分。在發酵過程中，茶氨酸含量大量降低，從0.718 g/100 g減少至0.367 g/100 g，降幅達48.88%，這與陳瑩玉[23]的實驗結果一致；人體必需的9種氨基酸中只有賴氨酸和蛋氨酸的含量減少，其余7種必需氨基酸的含量均明顯增多；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸作為芳香族氨基酸在發酵后含量均有所提高，它們含量的增加為茶湯增強了甜味的口感，在茶滋味中起著重要地協調作用；天冬氨酸是構成茶湯鮮爽滋味的重要成分，其含量由0.017 g/100 g增加至0.035 g/100 g。同時γ-氨基丁酸作為中樞神經系統中一種重要的神經遞質[23]，參與多種神經功能調節，是一類具有特殊生理活性的功能性物質，其含量在發酵后增至0.017 g/100 g。由此得出，紅茶經植物乳桿菌發酵后營養成分更加豐富，呈味物質增多，有利于茶飲料風味品質的改善和保健作用的加強。

表1 紅茶浸提液發酵前后游離氨基酸組分的變化Table 1 Changes in free amino acid component in black tea extract before and after fermentation g/100 g

2.4 紅茶浸提液發酵前后風味物質差異

揮發性成分構成了茶葉的香氣組成，因此鑒定茶葉中揮發性成分也是考察發酵型茶飲料品質的重要因素之一[24]。使用HS-SPME/GC-MS法對茶湯發酵前與發酵結束時的揮發性成分進行鑒定和對比。結果見表2。

表2 紅茶浸提液發酵前后揮發性成分的含量及種類變化Table 2 Changes of contents and types of volatile components in black tea extract before and after fermentation

由表2可知，原茶湯主要的香氣組分是醇類和醛類，是相對含量最多的兩類化合物；而發酵后茶湯香氣的主要來源是醇類和酸類，分別占揮發性成分總量的54.85%和13.72%。醇類和酸類化合物在發酵后大量增加；而醛類物質經發酵后明顯地減少，可能是在乳酸菌發酵過程中發生了強烈的氧化作用，使得大量醛類物質進一步氧化成酸類物質，實現了這些物質的轉化。

由表2可知，浸提液發酵前后香氣種類均為醇類、醛類、酮類、酯類、酸類、碳氫化合物、含氮化合物及其他物質，其中以醇類為主要的香氣成分類型，占總量的40.10%～54.85%，說明醇類化合物是賦予茶樣香氣的基礎。

紅茶浸提液在發酵前后香氣成分變化明顯，浸提液中共檢測出88種香氣物質，主要的香氣成分類型為醇類、醛類和酮類，占香氣物質總量的81.04%；發酵后共檢測出94種香氣物質，主要的香氣成分類型為醇類、酸類和醛類，占香氣物質總量的77.61%。發酵后較發酵前多6種香氣物質，說明發酵液中香氣成分更加豐富，在原有的紅茶風味的基礎上增添了全新的發酵風味，提高了茶湯整體香氣的層次感和濃郁感[25]。浸提液經發酵后，醇類化合物、酸類化合物和含氮化合物均顯著增多，相對含量占比分別由浸提液中40.10%、3.71%、0.93%增加至54.85%、13.72%、5.46%，分別增加了14.75%、10.01%、4.53%，同時有8種醇類化合物、9種酸類化合物、6種含氮化合物生成。這些新物質的生成是構成發酵茶飲料獨特香氣的關鍵；醛類化合物種類及含量在發酵后顯著減少，相對含量占比從32.39%減少至9.04%，有14種醛類化合物在發酵后未被檢測到。酮類、酯類、碳氫化合物發酵前后變化不明顯。

3 結論

紅茶經植物乳桿菌發酵后，茶多酚含量減少，氨基酸總量增加，蔗糖含量減少且pH值降低，酸度升高。這主要是由乳酸菌在發酵過程中會利用蔗糖代謝產生有機酸所致，同時濕熱條件下也導致茶葉中茶多酚發生氧化使得茶多酚含量降低，因此，發酵后的紅茶飲料具有更低的酚氨比，利于降低茶本身的苦澀感，增強茶飲料的酸感和發酵風味。

紅茶經植物乳酸菌發酵后，三種芳香族氨基酸分別增加了43.16%、68.79%、83.18%；人體必需氨基酸中除賴氨酸和蛋氨酸含量減少外，其他7種必需氨基酸含量均有所提高；γ-氨基丁酸作為功能性氨基酸，含量從0.016 g/kg增加至0.165 g/kg。風味品質方面，醇類和醛類是浸提液的主要香氣物質，分別占香氣物質總量的40.10%、32.39%；發酵型茶飲料檢測出的香氣成分為94種，比浸提液多6種香氣物質，新物質以酸類、醇類和含氮化合物居多，而醛類物質在發酵過程中大量減少，有14種醛類化合物在發酵后未被檢測到。發酵型茶飲料香氣成分更加豐富，在原浸提液的基礎上增添了乳酸菌發酵的風味，融合出更協調細膩的味道，形成發酵型茶飲料的獨特風味。