苦豆子中黃酮類物質提取工藝優化及其體外生物活性研究

李會玲，黃紅艷，張路敏，葸慧敏，楊善德，孫曉杰，雷玉明，曹 禮*

（1.河西學院 生命科學與工程學院，甘肅 張掖 734000；2.河西學院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

苦豆子（Sophora alopecuroides）廣泛分布于我國西北部荒漠鹽堿地帶，是西北地區重要的自然植被的組成部分和藥用植物資源[1]。苦豆子整株和種子皆可入藥[2]，具有清熱解毒、止痛消炎、殺蟲舒胃、抗腫瘤、抗氧化除自由基活性、保肝、醫治糖尿病等藥理活性[3-5]，可用于咽喉腫痛、急性痢疾、皮膚瘙癢、胃痛等多種疾病的治療[6-7]。

苦豆子中含有多種生物活性物質，僅生物堿的種類多達20多種[8]，其中黃酮類物質的含量較高[9]。苦豆子中的黃酮類物質，具有廣譜抗菌和抗病毒作用，可以用于生物防治、生物農藥、降低血脂、降低血液粘稠度、延長紅血球壽命，增強造血功能、抑制腫瘤細胞增長等[10-13]。因此，苦豆子生物質資源的合理開發和利用，受到越來越多的關注。

響應面分析法是通過有效的試驗設計，擬合試驗因素與響應值之間的函數關系得到回歸方程，進一步分析回歸方程，可獲得到各因素的最佳工藝參數，可用于優化多因素的一種有效統計方法。當前，黃酮類物質的提取方法主要有浸漬法、微波提取法、溶劑提取法[14]、超臨界流體萃取法[15]，也可通過大孔樹脂吸附法、金屬絡合法和硅膠分離法等精制黃酮類物質[16]。本研究運用乙醇浸取法提取苦豆子中黃酮類化合物，采用單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗設計，運用Design-Expert V8.0.6軟件建立苦豆子中黃酮類提取物得率的二次回歸模型和確定其最佳提取條件，并對苦豆子提取液進行抗氧化試驗和抑菌活性研究，為研究苦豆子中黃酮類提取物的綜合利用與開發提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦豆子：市售；蘆丁標準品（純度＞98%）、2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司。

LB（Luria-Bertani）固體培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：生工生物工程（上海）股份有限公司。

大腸桿菌（Escherichiacoli）、節稈菌（Arthrobacter）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）、青霉（Pencillium）：均為本實驗室保藏菌株。

1.2 儀器與設備

FW400A粉碎機：河北省黃驊市中興儀器有限公司；DK-8D數顯恒溫水浴鍋：金壇區西域新瑞儀器廠；UV-1200PC可見分光光度計：上海美析儀器有限公司；SW-CJ-JB標準型凈化工作臺：上海陽光試驗儀器有限公司；SHB-IIIA循環式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦豆子黃酮類物質提取物的制備

稱取苦豆子粉末2.0 g，置于50 mL的帶蓋的離心管中，分別在一定料液比、浸出時間、乙醇體積分數、浸取溫度下提取苦豆子中的黃酮類物質，每隔1 min搖勻一次，將得到的提取液進行過濾，過濾后的上清液旋蒸濃縮，得到黃酮類物質提取物。

1.3.2 黃酮類物質的提取工藝優化

（1）單因素試驗

各取2.0 g苦豆子粉末，分別以乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、浸提時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、浸提溫度（70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））為考察對象，研究不同因素對苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響。

（2）響應面試驗

根據單因素試驗的結果，采用Box-Behnken響應面試驗設計法，進一步優化黃酮類物質的提取條件，分別以乙醇體積分數（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）為考察因素，黃酮類物質提取物得率（Y）為響應值。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 黃酮類化合物含量的測定及得率的計算

參考文獻[17]中的方法，以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標、于波長510 nm處測定的吸光度值（y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，得標準曲線回歸方程為y=0.059 87x-0.046 70，相關系數R2=0.999 1。樣品中黃酮類提取物的得率計算公式如下[15]：

式中：E為樣品中黃酮類提取物得率，mg/g；x為樣液中黃酮類物質含量，mg；m為苦豆子粉末的質量，g；p為樣品的稀釋倍數。

1.3.4 黃酮類物質的抗氧化活性

還原力的測定：參考文獻[18]；DPPH自由基清除能力的測定：參考文獻[19]；抗氧化劑清除DPPH自由基能力采用半抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）值表示。同時以BHT作為抗氧化性陽性對照。

1.3.5 黃酮類物質的抑菌活性

采用濾紙片法[20]。各供試菌株活化后液體培養，離心，留離心管底少量液體，混勻，分別吸取150 μL各供試菌株懸液涂布在相應的培養基（大腸桿菌、節桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌涂布在LB固體培養基，黑曲霉、根霉、青霉涂布在PDA固體培養基）上，將無菌濾紙片貼在上述含菌的固體培養基表面，取方法1.3.1中所得苦豆子黃酮類提取液濃縮液100 μL滴加于濾紙片上，培養，觀察結果并拍照記錄。當抑菌圈直徑＞7 mm時，則表明具有抑菌活性，抑菌圈直徑≤7 mm，判為無抑菌作用。

1.3.6 數據處理

使用Origin 9.0及Design-Expert V8.0.6軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分數在50%～90%范圍內的增加，苦豆子中黃酮類物質提取物得率先增大后減小。在乙醇體積分數為50%～70%時，黃酮類物質提取物的得率隨之增加；在乙醇體積分數為70%時，黃酮類物質提取物的得率最大，為10.59 mg/g；當乙醇體積分數為70%～90%時，苦豆子中黃酮類物質提取物的得率反而降低。可能是由于苦豆子中黃酮類物質易溶于乙醇、甲醇等極性強的溶劑，所以在乙醇體積分數增加至70%時，苦豆子中黃酮類物質提取物得率逐漸增加；而繼續增加乙醇體積分數，苦豆子中的一些醇溶性雜質、親脂性的成分浸出量增加，與黃酮類物質提取物競爭乙醇分子，從而導致黃酮類物質提取物提取率降低。因此，最適乙醇體積分數為70%。

圖1 乙醇體積分數對苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.2 浸提時間對黃酮類化合物得率的影響

由圖2可知，隨著浸提時間在1～5 h范圍內的延長，苦豆子中黃酮類物質提取物的得率先增大后減小。當浸提時間在1～2 h時，黃酮類物質提取物得率隨之增加；當浸提時間在2 h時，黃酮類物質提取物得率達到最大，為10.56 mg/g；當浸提時間＞2 h之后，隨浸提時間的延長，苦豆子中黃酮類物質提取物得率快速下降。原因可能是有機溶劑完全浸透到苦豆子細胞中需要一定的時間，短時間內黃酮類物質提取物不能充分溶出；而超過2 h后，糖和蛋白質溶出增加，部分黃酮類物質提取物遭到破壞。因此，最適浸提時間為2 h。

圖2 浸提時間對苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.3 浸提溫度對黃酮類化合物得率的影響

由圖3可知，隨著浸提溫度在70～90 ℃的增加，苦豆子中黃酮類物質提取物的得率先增大后減小。當浸提物質溫度在70～80 ℃時，黃酮類物質提取物得率隨之增加；當浸提溫度達到80 ℃時，黃酮類物質提取物得率達到最大，為10.48 mg/g；而當浸提溫度＞80 ℃時，隨浸提溫度的增高苦豆子黃酮類物質提取物的得率又快速降低。原因可能是隨著溫度的升高，分子擴散能力增強，有利于黃酮類物質的溶出；當溫度高于80 ℃時，黃酮類某些熱不穩定的化合物被氧化，或者部分黃酮類化合物轉化成槲皮素和異槲皮素[21-22]，從而導致黃酮類物質提取物的得率降低。因此，最適浸提溫度為80 ℃。

圖3 浸提溫度對苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.4 料液比對黃酮類化合物得率的影響

由圖4可知，隨著料液比在1∶5～1∶25（g∶mL）范圍內變化，苦豆子中黃酮類物質提取物得率先增加后減小；在料液比為1∶5～1∶10（g∶mL）時，黃酮類物質提取物得率隨之增加；在料液比為1∶15（g∶mL）時，苦豆子中黃酮類物質提取物得率最大，為10.60 mg/g；在料液比為1∶15～1∶25（g∶mL）時，黃酮類物質提取物得率隨之下降。因此，最適料液比為1∶10（g∶mL）。

圖4 料液比對苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面試驗設計法，以乙醇體積分數（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）為考察因素，黃酮類物質提取物得率（Y）為響應值，優化黃酮類物質的提取條件[23]。Box-Behnken試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

采用Design-Expert V8.0.6軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得二次多項回歸方程：Y=10.80+0.47A+0.033B+0.41C+0.60D+0.027AB+0.55AC-0.059AD-0.38BC-0.029BD-0.050CD-0.70A2-0.50B2-0.69C2-1.17D2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

由表3可以看出，模型顯著性P值＜0.01，表明該模型具有統計學意義；失擬項P值＞0.05，不顯著，說明所用模型與試驗擬合的程度較好。變異系數（coefficient of variation，CV）=3.68%＜10%，表明試驗可行度較高。模型決定系數R2=0.928 5，校正決定系數R2adj=0.857 0＞0.80，說明該模型能較好反映苦豆子中黃酮類提取物得率與乙醇體積分數、浸取溫度、浸出時間和料液比的關系。一次項A、C、D、二次項A2、B2、C2、D2、交互項AC對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項BC對結果影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，從顯著性及F值大小可得，提取苦豆子中黃酮類物質提取物得率的影響因素大小依次為：料液比＞乙醇體積分數＞浸提溫度＞浸提時間。

2.2.2 響應面交互作用分析

根據回歸方程利用Design-Expert V8.0.6繪制乙醇體積分數（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）對黃酮類提取物得率影響大小的交互作用響應面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對苦豆子黃酮類提取物得率影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

由圖5可知，AC交互作用對黃酮類物質提取物得率影響極顯著（P＜0.01），BC交互作用對黃酮類物質提取物得率影響顯著（P＜0.05），并且從三維立體圖中可以確定各交互因素間能得最優黃酮類提取物得率提取的范圍值。

2.2.3 最佳提取工藝條件驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6.0軟件對工藝條件進行優化，得到苦豆子中黃酮類物質最佳提取條件為乙醇體積分數75.36%、浸提時間1.83 h、浸提溫度82.73 ℃、料液比1∶11.15（g∶mL），在此工藝條件下黃酮類提取物得率預測值為11.105 mg/g。為了便于工藝操作，將最佳提取工藝條件修正為：乙醇體積分數75%、浸提時間1.8 h、浸提溫度83.0 ℃，料液比1∶11（g∶mL）。在此條件下，得到黃酮類提取物得率實測值為（10.99±0.31）mg/g，與預測值接近，表明該模型可以較好地反映苦豆子中黃酮類提取物提取條件。有文獻報道，苦豆子黃酮類提取物得率一般在4.98 mg/g左右[24-25]，本試驗得率是其2倍左右，其原因可能是由于新疆地區獨特的生態環境和苦豆子品種有一定的關系。

2.3 體外抗氧化性試驗

2.3.1 還原力測定結果

由于BHT抗氧化效果好并且便宜而曾經被廣泛應用，但是對人體具有致癌、致畸作用，現已被一些國家禁用。如圖6所示，在試驗范圍內，苦豆子黃酮類物質提取物的還原力隨著質量濃度增加而增加，且與BHT的還原力大致相當；在質量濃度為0.092 mg/mL時，苦豆子中黃酮類物質提取物對應的吸光度值為0.611，而同濃度的BHT此時對應的吸光度值是0.609，表明相同質量濃度下苦豆子中黃酮類物質提取物的還原力略大于BHT的還原力。

圖6 BHT和苦豆子黃酮類物質提取物還原力的比較Fig.6 Comparison of reducing power of BHT and flavonoids extract from Sophora alopecuroides

2.3.2 清除DPPH自由基的測定結果

一般而言，物質的還原力和抗氧化性具有很強的相關性，還原力大則具有較強的抗氧化性。如圖7所示，隨著苦豆子黃酮類物質提取物質量濃度增加，清除DPPH自由基的能力也逐漸增大，苦豆子中各黃酮類化合物濃度在試驗劑量范圍內與清除DPPH 自由基能力呈非線性正相關關系。以IC50值作為評價各試樣清除DPPH自由基能力的指標。采用該法測定的BHT和苦豆子中黃酮類物質提取物的IC50值分別為0.032 2和0.029 7。IC50值越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強[19]。由此得出苦豆子中黃酮類物質提取物的DPPH自由基清除能力強于BHT。

圖7 BHT和苦豆子黃酮類物質提取物對DPPH自由基清除率的比較Fig.7 Comparison of DPPH radicals scavenging rate of BHT and flavonoids extract from Sophora alopecuroides

2.4 抑菌試驗結果

如圖8所示，苦豆子中黃酮類物質提取物濃縮液，滴加到涂有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節桿菌和大腸桿菌的培養基上，培養一段時間后有明顯的抑菌圈出現；而滴加到涂有黑曲霉、青霉和根霉的培養基上，培養后無抑菌圈。馮俊濤等[21]曾對西北地區的苦豆子等187種植物進行了殺菌活性初步篩選，結果表明苦豆子丙酮提取物對番茄灰霉病等多種植物病原菌有較高的抑菌活性。本試驗中，苦豆子中黃酮類提取物濃縮液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節桿菌、大腸桿菌有明顯的抑菌活性，但是對黑曲霉、青霉、根霉無抑菌活性，這說明不同來源的苦豆子中黃酮類提取物成分可能不同。

圖8 苦豆子中黃酮類物質提取物對供試菌株的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of flavonoids extract from Sophora alopecuroides on tested strains

3 結論

本試驗采用乙醇浸提法提取苦豆子中黃酮類物質，在單因素試驗基礎上通過響應面中心組合試驗設計，建立了苦豆子中黃酮類物質提取物提取量的二次多項式回歸方程，得到提取苦豆子中黃酮類物質最佳條件為乙醇體積分數75%、浸提時間1.8 h、浸提溫度83.0 ℃、料液比1∶11（g∶mL）。在此優化條件下，苦豆子中黃酮類物質提取物得率為（10.99±0.31）mg/g。體外抗氧化性和抑菌活性研究試驗證明，苦豆子中的黃酮類提取物的還原力和清除DPPH自由基的能力與BHT相近，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節桿菌、大腸桿菌等的生長有明顯的抑制作用，在防腐、食品保鮮和醫藥方面有潛在的應用價值。