嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯含量測定方法的研究

張紅霞，盧克剛，梁秀清，陳倩倩，王艷麗，劉艷明*，胡 梅，祝建華

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東職業(yè)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104）

氯丙醇酯（chloropropanol esters）是近年來備受關(guān)注的一類食品污染物，按氯丙醇種類不同可分為單氯取代的3-氯-1,2-丙二醇酯（3-monochloropropane-1,2-diol ester，3-MCPDE）和2-氯-1,3-丙二醇酯（2-monochloropropane-1,3-diol ester，2-MCPDE）以及雙氯取代的1,3-二氯-2-丙醇酯（1,3-DCPE）和2,3-二氯-1-丙醇酯（2,3-DCPE）[1-2]。雖然氯丙醇酯自身的毒性尚無定論，但在人體脂肪酶作用下可水解為氯丙醇，氯丙醇具有致癌性、致突變性、腎臟毒性和生殖毒性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，氯丙醇酯廣泛存在于玉米油、芝麻油、菜籽油和棕櫚油等[5-8]精煉植物油以及烘烤食品和油炸食品等[9-11]熱加工食品中，其中檢出率較高的為單氯取代的3-MCPDE與2-MCPDE，而雙氯取代的氯丙醇酯少有檢出[12-14]。嬰幼兒配方乳粉在生產(chǎn)工藝中為了匹配母乳中脂肪的含量和組成，通常添加玉米油、大豆油、棕櫚油等精煉植物油作為外源性脂肪補(bǔ)充，這就導(dǎo)致了配方乳粉中可能存在氯丙醇酯暴露風(fēng)險(xiǎn)，為了保障嬰幼兒飲食健康安全，嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯（尤其是3-MCPDE與2-MCPDE）的分析研究備受國內(nèi)外關(guān)注[15-16]。

目前氯丙醇酯含量的測定多采用間接測定法，即通過水解將氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為氯丙醇，以氯丙醇的含量表征氯丙醇酯的含量[17-20]。嬰幼兒配方乳粉的樣品處理方法通常有兩種：一是從乳粉樣品中直接提取氯丙醇酯（直接提取法）[21-23]；二是先提取乳粉樣品中脂肪再測定脂肪中的氯丙醇酯（提取脂肪法）[16，19，24-25]。提取脂肪法前處理過程繁瑣，溶劑使用量大，不易批量化檢驗(yàn)。

該研究以嬰幼兒配方乳粉為研究對象，在GB5009.191—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》第三法的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進(jìn)，比較了直接提取法和提取脂肪法兩種提取方法、苯硼酸衍生和七氟丁酰基咪唑衍生兩種衍生方法的差異，以期建立簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法，實(shí)現(xiàn)樣品的批量化處理，提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)效率，為嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯污染的數(shù)據(jù)分析和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方乳粉樣品：市售；3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯、2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸二酯、3-氯-1,2-丙二醇、2-氯-1,3-丙二醇、D5-3-氯-1,2-丙二醇、D5-2-氯-1,3-丙二醇（純度均≥98%）：北京曼哈格公司；D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯、D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸二酯（純度均≥98%）：加拿大TRC公司；苯硼酸、甲醇鈉、七氟丁酰基咪唑（純度均為97%）：上海阿拉丁公司；正己烷、甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、異辛烷、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher公司；乙醚、石油醚、氨水、乙醇、溴化鈉、濃硫酸、氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Aglient公司；R300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；MS3渦旋混合振蕩器：德國IKA公司；N-EVAP-45型氮吹儀：美國Organomation公司；3K15型高速離心機(jī)：德國Sigma公司；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

分別稱取適量的氯丙醇酯、氯丙醇及內(nèi)標(biāo)于10 mL的容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，制備質(zhì)量濃度為1 000 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)儲備液。用乙酸乙酯稀釋成質(zhì)量濃度均為100 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)中間液。分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)中間液，用乙酸乙酯稀釋成質(zhì)量濃度均為2 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、酯混合內(nèi)標(biāo)工作液、醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和醇混合內(nèi)標(biāo)工作液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均在-18 ℃條件下保存。

甲醇鈉-甲醇溶液（25g/L）：稱取甲醇鈉2.5g，加入100mL甲醇，攪拌使其充分溶解。酸化溴化鈉溶液（600 g/L）：稱取60 g溴化鈉溶解于100 mL水中，加入3.5 mL 25%的硫酸。乙醚-乙酸乙酯溶液（6∶4，V/V）：量取60 mL乙醚，加入40 mL乙酸乙酯，混勻。苯硼酸溶液：稱取200 mg苯硼酸，加入10 mL乙醚，渦旋，制成苯硼酸飽和的乙醚溶液，取上清液使用。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取

直接提取法：稱取0.5 g乳粉樣品（精確到0.1 mg）于15 mL聚丙烯離心管中，加入50 μL質(zhì)量濃度為2 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的酯混合內(nèi)標(biāo)工作液，加入5 mL溫水，渦旋混勻，加入約1.8 g氯化鈉，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，超聲10 min，9 000 r/min離心6 min，取有機(jī)相于15 mL聚丙烯離心管。殘?jiān)偌尤? mL乙酸乙酯，渦旋2 min，9 000 r/min離心6 min，合并提取液。40 ℃水浴氮吹濃縮至近干，待水解。

脂肪提取法：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》[26]第三法（堿水解法）提取樣品中的脂肪。之后準(zhǔn)確稱取0.1 g脂肪提取物（精確至0.1 mg）于15 mL聚丙烯離心管中，加入50 μL質(zhì)量濃度為2 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的酯混合內(nèi)標(biāo)工作液，混勻，待水解。

（2）水解

于待水解樣中加入200 μL叔丁基甲基醚，渦旋混勻，加入200 μL甲醇鈉-甲醇溶液，渦旋混勻，室溫反應(yīng)3 min，立即加入600μL酸化溴化鈉溶液，渦旋30s，終止水解反應(yīng)并中和過量的甲醇鈉。加入1 mL正己烷，渦旋30 s，4 000 r/min離心2 min，棄去上層正己烷層，再加入1 mL正己烷重復(fù)一次，去除非極性雜質(zhì)成分。水相中加入1 mL乙醚-乙酸乙酯溶液（6∶4，V/V），渦旋1 min，8 000 r/min離心2 min，取有機(jī)相于10 mL具塞密閉玻璃管中，水相中再加入1 mL乙醚-乙酸乙酯溶液（6∶4，V/V）重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相，待衍生。

（3）衍生

七氟丁酰基咪唑衍生法：將待衍生液于40 ℃水浴氮吹濃縮至近干，加入1 mL異辛烷，加入50 μL七氟丁酰基咪唑，立即密塞，渦旋混合，70 ℃保溫20 min。取出冷卻至室溫，加入2 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋1 min，靜置分層。取異辛烷層，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，供氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定。

苯硼酸衍生法：向待衍生液中加入200 μL苯硼酸溶液，渦旋30 s，30 ℃反應(yīng)20 min。衍生反應(yīng)結(jié)束后，40 ℃水浴氮吹濃縮至近干。加入1 mL異辛烷復(fù)溶，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS測定。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣（He），純度≥99.999%，流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；視衍生方式不同分別采用不同的程序升溫：柱溫1（七氟丁酰基咪唑衍生物采用）：50 ℃保持5 min，以2 ℃/min的速度升至80 ℃，300 ℃后運(yùn)行5 min；柱溫2（苯硼酸衍生物采用）：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速度升至210 ℃，300 ℃后運(yùn)行5 min。

（2）質(zhì)譜條件

電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源，70 eV；離子源溫度：300℃；傳輸線溫度：280 ℃，四極桿溫度：180 ℃；掃描方式：選擇離子監(jiān)測（selectedionmonitoring，SIM）模式。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

取一系列醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入醇混合內(nèi)標(biāo)工作液，衍生化處理后經(jīng)GC-MS測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中含量采用內(nèi)標(biāo)法定量，本實(shí)驗(yàn)氯丙醇酯含量均以氯丙醇計(jì)（奶粉中）。用安捷倫MSD ChemStation軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，使用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜特征離子的考察

氯丙醇及其同位素內(nèi)標(biāo)經(jīng)七氟丁酰基咪唑或苯硼酸衍生后，其衍生物按1.3.3（1）色譜條件通過HP-5MS毛細(xì)管色譜柱均可實(shí)現(xiàn)良好分離，經(jīng)全掃描模式確認(rèn)特征離子碎片。3-MCPD和2-MCPD七氟丁酰基咪唑衍生物在電子轟擊下，C-O鍵斷裂，脫去-O（CO）C3F7后形成m/z 289和291的離子，繼續(xù)脫去-HCl形成m/z 253的離子，或脫去-CH2形成m/z 275和277的離子，或脫去-O（CO）C3F7后形成m/z 75和77的離子；3-MCPD和2-MCPD 苯硼酸衍生物的分子離子是m/z 196，同位素分子離子是m/z 195和198，3-MCPD苯硼酸衍生物失去-CH2Cl后形成了m/z 147和146的離子，2-MCPD苯硼酸衍生物失去-OCH2（CHCl）CH2后形成的m/z 104的離子；同位素內(nèi)標(biāo)與對應(yīng)的氯丙醇質(zhì)譜裂解機(jī)理相同。根據(jù)各離子碎片的響應(yīng)強(qiáng)度和干擾情況，確定兩種氯丙醇及內(nèi)標(biāo)衍生物的特征離子如表1所示。

表1 氯丙醇及其同位素內(nèi)標(biāo)衍生物的特征離子參數(shù)Table 1 Characteristic ion parameters of chloropropanol and its isotope internal standard derivatives

2.2 衍生方法的選擇

本研究以相同濃度的醇標(biāo)樣溶液，分別采用苯硼酸和七氟丁酰基咪唑兩種衍生試劑處理，衍生后的樣品在同一臺儀器上按照相應(yīng)的儀器條件進(jìn)行采集，通過考察衍生物的色譜峰響應(yīng)面積、對色譜柱的選擇性及影響，比較了兩種衍生方法的差異，結(jié)果見表2，4種MCPD衍生物的提取離子色譜圖見圖1。

表2 兩種衍生方法的比較Table 2 Comparison of two derivative methods

圖1 4種MCPD衍生物的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of four MCPD derivatives

由圖1可知，同濃度醇標(biāo)樣溶液的2種衍生物在色譜行為上相比較，七氟丁酰基咪唑衍生物峰形明顯好于苯硼酸衍生物，峰形更尖銳、對稱，方法靈敏度更高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯硼酸衍生法的上機(jī)液容易造成儀器的污染，并且對色譜柱有很大的破壞力。采集約60針樣品后就會出現(xiàn)明顯的色譜峰拖尾、響應(yīng)降低甚至不出峰、儀器背景快速升高、色譜柱柱效顯著降低等問題，致使儀器日常維護(hù)頻繁、色譜柱損傷嚴(yán)重、使用壽命極大縮短，工作效率大大降低。因此，本研究選用靈敏度高、耐用性好的七氟丁酰基咪唑衍生法。

2.3 直接提取法的條件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

氯丙醇酯是脂溶性物質(zhì)，分別選用乙酸乙酯、正己烷、甲基叔丁基醚、乙腈作為溶劑，提取后再經(jīng)水解和衍生化處理，采用氣相色譜-質(zhì)譜測定分析。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)（加標(biāo)水平0.10 mg/kg，以氯丙醇計(jì)），比較了提取溶劑對氯丙醇酯的選擇性，結(jié)果見表3。

表3 不同溶劑對氯丙醇酯的回收率Table 3 Recovery rate of chloropropanol esters with different solvents

由表3可知，乙酸乙酯提取液對目標(biāo)物的回收率均為98%以上；甲基叔丁基醚提取液回收率次之；正己烷提取時乳化嚴(yán)重，回收率偏低；乙腈提取時能同時沉淀蛋白，減小基質(zhì)共萃出，但對氯丙醇酯的選擇性較差，回收率最低。綜合對比，本研究選用了毒性較小、選擇性好的乙酸乙酯為提取溶劑。

2.3.2 堿水解試劑用量和水解時間優(yōu)化

在堿水解過程中，氯丙醇酯在甲醇鈉作用下發(fā)生酯鍵斷裂生成氯丙醇，甲醇鈉用量過多或水解時間過長都會引起氯丙醇的降解，導(dǎo)致方法靈敏度的降低[20]。實(shí)驗(yàn)以氯丙醇酯檢出陽性的嬰幼兒配方乳粉樣品為研究對象，按照直接提取法進(jìn)行樣品提取得待水解樣，于待水解樣中加入200 μL叔丁基甲基醚，渦旋混勻，待水解，分別設(shè)置不同的水解試劑用量和水解時間對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

于加入200 μL叔丁基甲基醚的待水解液中加入甲醇鈉-甲醇溶液，設(shè)置甲醇鈉-甲醇溶液用量分別為50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL，水解時間為3 min。水解結(jié)束后采用七氟丁酰基咪唑衍生，GC-MS分析，分別考察水解產(chǎn)物氯丙醇定量離子色譜峰響應(yīng)面積的變化，每個條件分別做3次平行，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCPD及其內(nèi)標(biāo)衍生物響應(yīng)面積隨著堿水解試劑用量的增多逐漸升高，在試劑用量為200 μL時，MCPD及其內(nèi)標(biāo)衍生物響應(yīng)面積到達(dá)峰值，而后逐漸降低后保持平緩，為了提高實(shí)驗(yàn)靈敏度，便于準(zhǔn)確定量，所以選擇最佳甲醇鈉-甲醇溶液用量為200 μL。

于待水解液中，加入200 μL甲醇鈉-甲醇溶液，水解時間分別設(shè)定為0.5 min、1.0 min、2.0 min、3.0 min、4.0 min、6.0 min、10.0 min，水解結(jié)束后采用七氟丁酰基咪唑衍生進(jìn)行GC-MS分析，分別考察水解產(chǎn)物氯丙醇定量離子色譜峰響應(yīng)面積的變化，每個條件分別做3次平行，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，MCPD及其內(nèi)標(biāo)衍生物響應(yīng)面積隨著水解時間的延長，先逐漸升高，在水解時間3 min時到達(dá)峰值后又逐漸降低，所以選擇水解時間3 min為最優(yōu)條件。

圖2 堿水解試劑用量（A）及水解時間（B）對MCPD衍生物響應(yīng)的影響Fig.2 Effect of alkali hydrolysis reagent dosage (A) and hydrolysis time (B) on MCPD derivatives response

2.4 直接提取法的方法學(xué)研究

2.4.1 線性范圍和定量限

分別移取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL質(zhì)量濃度為2 mg/L的醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入2 mg/L醇混合內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，將標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行七氟丁酰基咪唑衍生化處理后，按相應(yīng)儀器條件測定分析。以氯丙醇衍生物與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)衍生物的定量離子響應(yīng)面積之比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表4。

由表4可知，目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白嬰兒配方乳粉基質(zhì)中添加氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.010 mg/kg、0.020 mg/kg、0.050 mg/kg（以氯丙醇計(jì)），按照直接提取法進(jìn)行處理，以3倍、10倍信噪比對應(yīng)的含量分別為檢出限、定量限，確定了方法檢出限、定量限分別為0.003 mg/kg、0.010 mg/kg。

表4 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equation,correlation coefficient,LODs and LOQs of target compounds

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度

在空白嬰兒配方乳粉基質(zhì)中分別添加氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01 mg/kg、0.10 mg/kg和0.20 mg/kg（以氯丙醇計(jì)），按直接提取法進(jìn)行處理，每個加標(biāo)水平做6個平行，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表5。結(jié)果表明，3個濃度水平加標(biāo)的平均回收率在95.8%～115.7%之間，回收率試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～4.6%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度較好，能夠滿足嬰兒配方乳粉中氯丙醇酯定量分析的需要。

表5 目標(biāo)物在嬰幼兒配方乳粉中的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Results of adding standard recovery tests of target compounds in infant formula (n=6)

2.4.3 方法的精密度

選取1份嬰幼兒配方乳粉陽性樣品，分別稱取6份樣品，按直接提取法進(jìn)行處理，測定6個平行中氯丙醇酯的含量（以醇計(jì)），計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表6。由表6可知，2種氯丙醇酯的RSD分別為1.9%、2.2%，均＜5%，結(jié)果表明本方法測定結(jié)果穩(wěn)定、精密度良好，能夠滿足嬰兒配方乳粉中氯丙醇酯含量的檢測要求。

表6 方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 6 Results of precision tests of the method (n=6)

2.5 兩種提取方法的比較

本研究選用3份嬰幼兒配方乳粉陽性樣品和1份英國FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）質(zhì)控樣（編號：T2661QC，基質(zhì)為嬰兒配方乳粉，3-MCPDE、2-MCPDE的理論含量分別為0.050 2 mg/kg、0.019 0 mg/kg，以醇計(jì)）。按照樣品前處理方法分別進(jìn)行試驗(yàn)，分別采用直接提取法和提取脂肪法，比較提取方法對氯丙醇酯定量結(jié)果的影響，平行測定6次，結(jié)果見表7。由表7可知，兩種方法的測定結(jié)果無明顯差別，可以進(jìn)行相互驗(yàn)證。

表7 提取方法對氯丙醇酯定量結(jié)果的影響（n=6）Table 7 Effect of extraction methods on the quantitative results of chloropropanol esters (n=6)

3 結(jié)論

通過提取方式及衍生方法的選擇、提取溶劑、堿水解試劑用量和水解時間的優(yōu)化等多方面實(shí)驗(yàn)，本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中3-MCPDE和2-MCPDE含量的分析方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種氯丙醇酯在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度和精密度較高；七氟丁酰基咪唑衍生法比苯硼酸衍生法具有較好的耐用性和更高的靈敏度；直接提取法和提取脂肪法兩種方法定量結(jié)果差異不大，可以進(jìn)行相互驗(yàn)證，但直接提取法步驟簡便、高效、快速，可大大提高工作效率。綜上所述，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯的快速批量測定，可以為嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和暴露評估提供技術(shù)支持。