組織和時間特異性表達的鈣黏蛋白-16

葉洪亮， 張金三， 金立波

（1. 溫州大學 a. 生命與環境科學學院；b. 生命科學研究院，溫州 325035；2. 浙江省生物醫藥協同創新中心，溫州 325035）

鈣黏蛋白（cadherin，CDH）是一種Ca2+依賴的介導同源細胞間相互黏附的黏連糖蛋白家族。目前發現的CDH 成員超過100多種，根據其蛋白結構和功能的相似性，大致可分為4個亞家族：Ⅰ型典型的鈣黏蛋白、Ⅱ型典型的鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白［1］。這些鈣黏蛋白有相似的結構和生物學功能，大部分鈣黏蛋白成員在胚胎發育、組織完整性和細胞功能的維持中發揮著重要的作用［2-3］。例如，鈣黏蛋白-1（CDH-1，即E-cadherin）是Ⅰ型典型的鈣黏蛋白，在小鼠胎齡8.5天（E8.5）開始表達，其作用是將松散的分裂球細胞變成緊密黏合的細胞，Cdh-1基因突變會導致胚胎細胞的分離和死亡［4］。臨床研究表明，Cdh-1基因突變還會導致遺傳性彌漫性胃癌和乳腺小葉癌等癌癥［5］。鈣黏蛋白-2（CDH-2，即N-cadherin）影響眼、神經、心臟、骨骼肌及成纖維細胞的發育，在懷孕的小鼠中敲除Cdh-2基因會造成胚胎小鼠心臟缺陷并出現胚胎發育遲緩［6］。

鈣黏蛋白-16（CDH-16）是一種非典型鈣黏蛋白［7］。已有研究表明，CDH-16參與維持細胞形態與功能［8］，是癌癥發生的潛在檢驗節點［9-10］，還與胚胎發育過程緊密相關［9，11-12］，功能上具有顯著的組織選擇性。本文從CDH-16的組織特異性分布角度對其結構、功能及基因表達的時空調控展開綜述。這為將來更深入理解CDH-16蛋白在不同生物學進程中發揮的作用提供了理論基礎。

1 CDH-16的發現與結構

1995年，Thomson 等［13］學者首次通過免疫熒光揭示了CDH-16蛋白表達在兔腎臟上皮細胞的外側基底膜。當時被分析的9只兔子的組織只有腎臟中檢測到了CDH-16，因此，最初他們認為CDH-16特異性表達在腎臟中，并將其命名為腎特異性鈣黏蛋白（kidney specific cadherin，Ksp-cadherin）［13］。后來在小鼠和人類腎臟中進一步證實了CDH-16的表達［10，14］。

CDH-16蛋白分子量為130 kD，蛋白結構與典型CDH蛋白類似［13，15-18］，均為單次跨膜蛋白，包含胞內外結構域。不同的是，典型CDH蛋白一般擁有5個胞外重復結構域（extracellular cadherin repeat，EC）和1段由大約160個氨基酸殘基組成的C末端高度保守的肽段［19］，而CDH-16蛋白擁有7個胞外重復結構域和1段僅由22個氨基酸殘基組成的短鏈胞內結構域（圖1）。二者均依賴EC區域的Ca2+結合位點發揮黏附作用［3，20］。Ca2+結合賦予了鈣黏蛋白胞外部分剛性，使得一個細胞鈣黏蛋白的把手樣結構和另外一個細胞鈣黏蛋白的口袋狀結構彼此嵌合在一起，從而實現Ca2+依賴性的細胞黏著［21］。典型CDH蛋白的配體主要是鈣連環蛋白（catenin），包括α-catenin、β-catenin和δ-catenin［22-24］，二者形成的CDH-catenin復合物與細胞內的細胞骨架蛋白相互結合，調控細胞的黏附作用［25］。p120蛋白則通過結合CDH蛋白的近膜域發揮作用［26］。但CDH-16蛋白胞內結構域被截斷，因此缺少catenin的結合位點，轉而與另一種小分子熱休克蛋白——αB晶狀體蛋白（αB-crystallin，CRYAB）相互作用。αB-crystallin作為一種連接蛋白，充當CDH-16與絲狀肌動蛋白（filamentous actin，F-actin）相互作用的中間橋梁，三者在維持腎臟集合管上皮基膜處的結構完整性方面發揮重要作用［8］。

圖1 鈣黏蛋白結構Fig. 1 Cadherin structure

2 CDH-16的時空分布及功能

CDH-16的表達具有較高的時間和空間特異性（下文稱為時空特異性），不同生長發育時期分別表達于生殖管道、肺、腎臟和甲狀腺。CDH-16作為腎臟上皮細胞的生物指標，一直被視作細胞分化的標志，但其在肺和生殖管道中短暫表達的意義卻仍不明確，目前關于此方面的研究還有待深入。下面將從CDH-16在不同組織的分布與功能進行闡述。

2.1 CDH-16的暫時性表達

Cdh-16的轉錄產物在發育的生殖管道和肺中被檢測到。其中，Cdh-16在生殖管道的表達開始于E10.5，Wertz等［11］在此時期的沃爾夫管（Wolffian duct）和米勒管（Müllerian duct）中檢測到了Cdh-16的轉錄產物，但隨著沃爾夫管和米勒管分別發育形成輸精管和輸卵管、子宮、子宮頸以及上三分之一陰道后，Cdh-16轉錄產物消失。

Cdh-16轉錄產物也在小鼠發育的肺中被檢測到（E10.5～E14.5）（圖2a），并隨著肺的成熟而消失。小鼠肺的發育大致分為5個階段：胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期和肺泡期。E10.5～E14.5為胚胎期末期和假腺期早期，此時一群遠端尖部上皮祖細胞開始分化形成神經內分泌細胞、克拉拉細胞、纖毛細胞以及Ⅰ型肺泡上皮細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞［27］。由此可猜測，Cdh-16可能在這一階段參與了肺上皮的組建，在氣管分支時期的細胞分化過程中扮演了重要的角色。

圖2 CDH-16在胚胎發育期的分布Fig. 2 Distribution of CDH-16 during embryogenesis

2.2 CDH-16與腎臟

CDH-16是目前已知的CDH家族中唯一具有腎臟特異性分布的成員［13，28-29］。在發育的腎臟中，CDH-16表達在腎單位和分支的輸尿管芽中，但在濃縮的間充質、逗號小體和腎小囊中檢測不到CDH-16的表達［29］。這與Shao等［30］在Ksp1.3/Cre、lacZ轉基因小鼠中觀察到的CDH-16重組蛋白的分布一致。隨著輸尿管芽在后腎間充質的誘導下分支形成集合管，CDH-16的分布集中于成熟的集合管（圖2b），并因此被視為集合管分化成熟的標志［31］。在成年小鼠腎臟中，CDH-16分布于腎單位的所有節段，尤其是髓袢、遠端小管以及腎集合管，但在腎小球、血管或間質細胞中仍然檢測不到CDH-16的表達。因此，當含有熒光素酶報告基因和2.6 kbCdh-16啟動子的質粒轉染腎上皮細胞時，熒光素酶活性被刺激增加48～60倍，而轉染到間充質細胞時，熒光素酶活性小于2倍［20］。

CDH-16在腎臟中的作用主要包括：1）介導Ca2+依賴的細胞識別與黏附［17］。一項體外試驗表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）通過CDH-16誘導腎成體干細胞的分化［32］，CDH-16在此發揮了細胞間相互識別的作用。2）Cdh-16在腎臟中被視為腫瘤抑制基因，腎細胞癌中CDH-16的表達顯著下降，甚至完全消失［10］。3）最新的研究發現，CDH-16與腎臟正常代謝尿液的功能直接相關。在小鼠腎臟中敲除Cdh-16基因，結果發現，這雖然不影響腎臟的正常發育及結構完整性，但會引起髓內水通道蛋白-2（aquaporin，AQP-2）的錯誤表達，從而導致腎臟濃縮尿液功能障礙［7］。這也首次證明了CDH-16不僅僅是一種細胞黏連的結構蛋白，還是一種與代謝相關的功能蛋白。

2.3 CDH-16與甲狀腺

在發育的小鼠甲狀腺中，CDH-16最早于E9.5被檢測到，此時CDH-16和CDH-1共表達于甲狀腺基板處的Pax8+/ Nkx2.1+祖細胞亞群［9］（圖2c）。CDH-1的黏連作用保證了發育早期甲狀腺的結構完整性，若在小鼠甲狀腺中敲除Cdh-1基因，CDH-16將作為替補鈣黏蛋白表達，并維持甲狀腺細胞的形態和結構［12］。此外，此前一直將Cdh-1突變視作甲狀腺癌的標志，但在甲狀腺癌中檢測到CDH-16表達缺失，且早于CDH-1表達缺失，說明CDH-16可能是未來檢測甲狀腺癌的新節點［9］。

CDH-16在甲狀腺中的表達受轉錄因子Pax8的調控。生物信息學初步分析表明，Cdh-16啟動子中存在潛在的Pax8結合位點。在大鼠甲狀腺細胞中沉默Pax8的表達，則CDH-16蛋白的表達受抑制［33］。值得注意的是，CDH-16基因的表達與其他甲狀腺特異性基因一樣，受到促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的調控，通過觀察dbcAMP（TSH類似物）處理TSH饑餓細胞可證實這一點。Pax8本身的表達在出生后受到TSH的控制［9］，因此，TSH可能通過Pax8轉錄因子調控CDH16的表達水平。這樣看來，腎臟也表達Pax8轉錄因子，也許兩種組織共有的Pax8轉錄因子可能是CDH-16組織選擇性的原因之一。

3 Cdh-16基因序列特征及表達調控

CDH-16蛋白的組織特異性表達受到Cdh-16基因水平上的精密調控。與其他典型鈣黏蛋白家族成員相同，Cdh-16基因也定位于小鼠8號染色體和人類16號染色體［34］，其啟動子近端120 bp序列在小鼠和人類之間高度保守［35］。早在1999年，為了更好地探究Cdh-16的組織特異性表達和發育調控，Whyte的實驗室克隆并表征了3.7 kbCdh-16基因5′端側翼序列。結果發現，Cdh-16基因上游250 bp區域內的基因序列與其表達相關，包括激活蛋白-2（AP-2）、肝細胞轉錄因子（HNF-3）、堿性螺旋環螺旋蛋白（bHLH）、C/EBP（CCAAT增強子蛋白）和GATA等［20］。而后進一步發現，Cdh-16基因上游存在腎臟上皮細胞特異性啟動子結合位點，這就解釋了CDH-16在腎臟中的選擇性表達。近年來，一些學者相繼構建了不同大小的啟動子探究CDH-16重組蛋白在腎臟中的特異性表達（表1），結果發現，0.3 kb啟動子即可調控Cdh-16基因的正常表達。

表1 重組蛋白CDH-16的表達模式及其分布Tab. 1 Expression and distribution of the recombinant protein CDH-16

此外，Cdh-16的表達還受肝細胞核因子-1β（HNF-1β）的調控［35-36］。Boutet等［37］發現，Snail的異常激活下調HNF-1β水平，CDH-16的表達受到抑制，導致腎纖維化。但由于在腎臟發育前敲除HNF-1β基因會導致胚胎死亡，故目前該基因的具體作用及其與CDH-16之間的關系仍不清楚［38-39］。

4 總結與展望

隨著研究的深入，CDH-16的生物學功能已經由細胞黏附拓展到了胚胎發育、代謝功能、腫瘤發生等。尤其在腎臟和甲狀腺中，CDH-16的表達異常已經在尿液代謝［7］、腎細胞癌［10］、腎纖維化［37］和甲狀腺癌［9］等有明顯的體現，具有重要的研究價值，但在肺和生殖管道中的功能卻尚無明確的結論。通過比較CDH-16在二者的表達差異可做出以下合理推測：生殖管道的成熟伴隨沃爾夫管和米勒管的退化，退化的組織中可能包含表達CDH-16的細胞，使得CDH-16在成熟的輸卵（精）管中消失；而在發育的肺中，CDH-16可能參與祖細胞分化過程。Nkx2.1+是肺和甲狀腺發育早期共同的祖細胞亞群，在甲狀腺Nkx2.1+/Pax8+細胞亞群檢測到CDH-16的分布似乎也暗示了其在肺Nkx2.1+細胞亞群中的表達。肺Nkx2.1+細胞亞群隨后分化為Sox2+近端和Id2+/Sox9+遠端內胚層祖細胞［41-42］，最終分化成熟形成氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞。為何CDH-16在成熟的肺中消失是值得深入思考的問題。未來可以利用Cre重組酶系統，在小鼠模型中對Cdh16+細胞進行熒光標記，追蹤這一細胞譜系的命運，并且針對消失后的CDH-16能否通過某種損傷機制被重新激活這一問題進行深入探討。此外，肺泡上皮細胞中分布著6種AQP水通道蛋白（AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9），在肺泡毛細血管間水的轉運中發揮著重要作用，可能參與了出生時肺泡液體的吸收、氣道的濕化、肺水容量的調節及肺水腫的形成［43］。CDH-16在腎臟上皮細胞中通過AQP2影響腎臟代謝功能［7］，這就提示：若在發育的肺中敲除Cdh-16基因，可能會影響成年小鼠肺氣體交換的效率或引起肺水腫等疾病。有研究證實，Cdh-1在肺癌中作為致癌基因誘導肺癌干細胞自我更新［44］，與其在胚胎干細胞和成體干細胞中發揮的作用一致，這為探究Cdh-16與肺癌的關系新增了一個角度。因此，以發展的眼光看，攻破CDH-16在生命體的作用及機制將有益于包括癌癥在內的多種疾病的臨床研究和治療。