紅斑馬魚體色觀察及敲除mitfa基因對其體色發育的影響

王 梅，張永勤，黃 靖，彭亮躍，劉文彬，肖亞梅，劉錦輝

（省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081）

體色是動物的基本特征之一，而身體顏色和圖案是體色的重要特征，在其生存和繁殖中發揮著重要作用。魚類體色是由皮膚以及皮膚衍生物鱗片上的色素細胞的種類和分布決定的［1-3］。色素細胞主要包含六類，分別是紅色素細胞、黃色素細胞、黑色素細胞、虹彩細胞、白色素細胞和鱖類中的藍色素細胞［4-6］。不同的色素細胞包含不同的色素顆粒，色素顆粒的遷移和分布均會導致體色的改變。不同魚色素細胞的種類也存在差異，斑馬魚和黑棘鯛具有三類色素細胞，分別是黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞［7-8］；青鳉除了具備黑色素細胞、黃色素細胞、虹彩細胞三類色素細胞外，還包括相對少見的白色素細胞［9］；鯉［10］、鯽［11］、血鵬鵝［12］等觀賞魚類的色素細胞有四類，分別是黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、鳥糞素細胞。紅斑馬魚原產于印度，個體小、易于飼養和繁殖，是一類比較受歡迎的觀賞性魚類。其胚胎透明，成活率較高，且成熟期周期短，成熟期雌雄斑馬魚可3～5 d進行一次催產，是比較常用的模式生物之一，被廣泛應用于物種遺傳、發育等研究中［13-14］，但目前關于紅斑馬魚的體色研究還沒有詳細的報道。

魚類體色的形成本質上是受遺傳基因控制的，主要包括膜受體基因、轉運調控基因、配體基因和合成途徑中相關酶類基因等［15］，而這些基因則主要通過對不同類別的色素細胞調控起作用。在對色素細胞的認知中，黑色素細胞是當前國內外研究最為廣泛而深入的色素細胞。黑素細胞誘導轉錄因子（melanocyte inducing transcription factor，MITF）作為體色遺傳調控信號通路上的核心調控因子，對黑色素合成和存儲起到主要的轉錄調控作用［16-17］。MITF有MITFA和MITFB兩個亞型，MITFA對于神經脊黑色素細胞的分化和發育是必須的，包括調控黑色素標記物多巴色素互變異構酶 (dopachrome tautomerase，DCT) 的表達和黑色素細胞的分化，以及分化后黑色素細胞樹突形式的維持［18-19］。已報道的研究認為，在干細胞中mitfa基因是非必需的，但mitfa在胚體中表達，且對于維持黑色素發育前體是必不可少的，mitfb則主要在視網膜色素上表達。這表明mitfa基因對胚胎型和成體型魚類黑色素細胞均具有功能［20］。黑色素的合成通路是對黑色素色素沉著機制研究的重要進展，包括黑色素合成、轉運和代謝［21-22］。α-黑色素細胞刺激素（alphamelanocyte stimulating hormone，α-MSH）參與黑色素的合成［23］。黑皮質激素-1受體與α-MSH結合，在G蛋白的作用下，可誘導環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的增加，通過cAMP依賴性蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase，PKA）發揮信號分子作用［22-25］，引發MITF、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相關蛋白酶1（tyrosinase related protein 1，TRP1 ）、酪氨酸酶相關蛋白酶2（tyrosinase related protein 2，TRP2）的表達上調，刺激黑色素的合成［26］。

CRISPR/Cas9作為一種比較新型的敲除技術，Cas9蛋白和目的基因gRNA形成混合物，通過與PAM序列結合并且入侵DNA，形成DNA-RNA復合物，進而對DNA進行切割，使DNA雙鏈斷裂，從而形成缺失或突變［27，30-31］。目前該技術在斑馬魚中應用廣泛［30］。本試驗通過CRISPR/Cas9技術，構建紅斑馬魚mitfa基因敲除體系，探究mitfa基因在紅斑馬魚體色形成中的作用，驗證其對早期黑色素細胞的發育和分化產生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅斑馬魚（Brachydanio rerio）來自中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心。

1.2 紅斑馬魚魚鰭色素細胞觀察

將紅斑馬魚通過MS-222麻醉后，準備好鑷子、剪刀，使用75%酒精進行消毒，在顯微鏡下分別剪取背鰭、臀鰭、腹鰭、胸鰭，用鑷子夾取鱗片，使用生理鹽水清洗干凈后制成臨時裝片，使用光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3 紅斑馬魚早期體色發育過程的觀察

取已足三月齡、性成熟的雌雄紅斑馬魚進行體外人工受精。收集胚胎，體式顯微鏡下觀察胚胎發育過程以及早期體色的形成。選擇胚胎時，需要取同一批次同一時期的胚胎，一批次胚胎通常200～300枚，篩選10～20枚質量相對比較好的胚胎進行觀察，拍照并記錄總結色素發育的一般特征。

1.4 紅色斑馬魚mitfa基因的敲除

從NCBI數據庫中選取斑馬魚mitfa基因序列，序列號為NM_130923.2，第二號外顯子上NGG前面20 bp為靶序列，在ZiFiT軟件 (http://zifit.partners.org/ZiFiT/)中輸入斑馬魚mitfa基因第二號外顯子序列，得到了20 bp的堿基序列作為靶向序列。通過PCR方法合成DNA靶向序列，其中合成gRNA模板的正向引物為：TGTAATACGACTCACTATAGGAGCGCTGGCTCCGGGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；合成gRNA模版的反向引物為：AAGCACCGACTCGGTGCCACT。

以P42250質粒［32］為模板進行PCR擴增，選擇PCR產物中的目的片段進行膠回收，進行gRNA體外轉錄，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的產物是否是目的條帶，并測濃度后置于-80℃分裝保存。將pT3TS-nzCas9n質粒［質粒載體菌種細胞基因保藏中心，貨號為pT3TS-nCas9n Bacterial Expression，CRISPRT3Cas9（Synthetic）］ 進行酶切得到的線性化質粒［33］作為體外轉錄的模板。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的產物是否是目的條帶，并測濃度后置于-80℃分裝保存。將所得的gRNA和Cas9 mRNA混合后進行顯微注射，體式顯微鏡觀察注射后的胚胎發育過程。選取3個月性成熟的雌/雄試驗斑馬魚，與三月齡野生型（wild type，WT）雌/雄斑馬魚進行雜交得到F1代雜合子，F1代自交獲得mitfa-/-純合子紅斑馬魚。其中F0代胚胎注射情況見表1，F1代獲得的雜合子和F2代得到的純合子情況見表2。

表1 胚胎顯微注射情況統計Tab. 1 Embryo injection statistics

表2 雜合子和和純合子獲得情況統計Tab. 2 Statistics of acquisition of heterozygotes and homozygotes

2 結果與分析

2.1 紅斑馬魚體色色素細胞的觀察

紅色斑馬魚整體背腹部以及兩側呈紅色，背鰭、臀鰭、尾鰭呈黃白條紋相間分布（圖1）。在顯微鏡下觀察其背鰭、臀鰭、腹鰭和胸鰭，發現背鰭有橙黃色色素細胞和黑色素細胞呈點狀均勻分布（圖2a），臀鰭有點狀和片狀的橙紅色色素細胞，但沒有黑色素細胞分布（圖2b），腹鰭為大量片狀的橙黃色色素細胞，無黑色素細胞（圖2c），同時在胸鰭中沒有黑色素細胞和黃色素細胞分布，也無虹彩細胞（圖2d）。體式顯微鏡下觀察紅斑馬魚各鰭基部鱗片，發現只有背鰭基部鱗片頂端有片狀的黃色素細胞。

圖1 紅斑馬魚背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭觀察位置Fig. 1 Observation positions of dorsal, pectoral, pelvic and anal fins of red zebrafish

圖2 紅斑馬魚背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭光學顯微鏡色素細胞觀察Fig. 2 Optical microscope observation of pigmented cells in the dorsal, pectoral, pelvic and anal fins of red zebrafish

2.2 紅斑馬魚早期體色色素發育的觀察

通過顯微鏡觀察發現，紅斑馬魚最先形成色素的區域為眼部虹膜形成的黑色素細胞，并逐漸增多（圖3a、3b），眼色素加深，黑色素沿著背部不斷向尾部遷移（圖3c），之后黃色素開始形成，由頭部向背部以及腹部遷移（圖3d）。頭部黑色素細胞形成樹突狀結構，黃色素細胞呈片狀，在頭部分布密集，在腹部分布相對稀疏。紅斑馬魚的發育過程，分變色前、變色中、變色后三部分。紅色斑馬魚變色前（圖3e、3f）可以看到頭部、背部以及腹部均有大量的點狀黑色素細胞，出膜第10天（圖3g），斑馬魚開始出現變色，首先是魚體肌肉變為淺紅，第15天（圖3h）淺紅色加深，背部可見黑色素細胞顆粒，并在發育后期，色素逐漸向各鰭上遷移，最終形成紅、銀白相間的成魚（圖3i）。

圖3 紅斑馬魚早期體色發育觀察Fig. 3 Observation on early body color development of red zebrafish

2.3 紅斑魚mitfa基因的敲除

首先，通過gRNA和Cas9 mRNA體外轉錄得到了所需的敲除體系，具體如圖4a所示。圖4b為Cas9和gRNA的體外轉錄結果，其中gRNA目的帶約為100 bp。通過構建CRISPR/Cas9mitfa基因敲除體系，成功得到了紅斑馬魚敲除的突變體，隨機敲除了mitfa第二號外顯子的6 bp和9 bp堿基序列。圖4c為敲除24個堿基的雜合序列的測序結果，通過F0代雜交獲得F1代雜合子，F1代自交最終得到了紅斑馬魚F2代mitfa-/-突變體（圖4d）。敲除mitfa基因后發現，試驗組皮膚黑色素細胞相對野生型紅斑馬魚明顯減少，且只有背部殘留少量的黑色素細胞，這表明mitfa基因在紅斑馬魚中同樣決定著黑色素細胞的命運。

圖4 紅斑馬魚mitfa基因敲除Fig. 4 mitfa gene knockout in red zebrafish

3 討論

魚類體色和斑紋形成在細胞水平上是色素細胞種類、分布及其相互作用的反映，是一種復雜的生物學過程。紅斑馬魚體表呈紅、銀白條紋相間，分布有紅黃色素細胞、黑色素細胞和少量的虹彩細胞，其豐富的體表特征為研究體色色素細胞提供了優良的材料。本文通過對紅斑馬魚體表的胸鰭、腹鰭、背鰭、臀鰭等部位進行觀察，發現了呈橙黃色點狀分布的紅色素細胞和片狀分布的黃色色素細胞。這一進步說明紅黃色素的形成與胡蘿卜素和蝶啶的含量比有關，若蝶啶多于類胡蘿卜素則形成黃色素細胞，反之則形成紅色素細胞［28］。嚴峻麗等［34］研究了圓斑星鰈早期發育過程中色素細胞的形成情況，結果顯示，最先生成的是黑色素細胞，其次是黃色素細胞，最后形成虹彩細胞；劉偉等［35］對鱖早期體色發育的研究發現，其色素細胞也是先形成黑色素細胞，其后是黃色素細胞，最后形成虹彩細胞。圓斑星鰈和鱖的體色發育均與紅斑馬魚早期體色發育相一致。觀賞魚類體色和斑紋直接決定了其觀賞價值和市場價值，多數觀賞魚類從仔魚到幼魚階段都存在一個重要的黑色素消退現象。一般出膜前后，魚體開始形成黑色素細胞且數目逐漸增加，體表主要呈黑色，而后再慢慢不同程度地褪去黑色，呈現不同的色澤或斑紋。Zhang等［36］揭示了紅鯽體色“灰轉紅”的變化過程，范云鵬等［37］闡述了關于花鯽魚“青轉花”的現象。紅斑馬魚早期色素發育過程中，變色前，背部首先形成黑色素細胞，逐漸增多并沿著背部和腹部遷移，此時也開始形成黃色素細胞并遷移；變色過程中，幼魚體表有少部分紅色素細胞形成，黑色素細胞減少，且部分消失，即出膜0～20 d黑色素細胞呈現增加的趨勢，從20 d左右開始呈現黑色素細胞減少的趨勢，直到黑色素細胞完全消退。大部分觀賞魚性周期長，紅斑馬魚為存在“黑色素消退”現象的觀賞魚提供了一種新的模式動物。

MITF參與多個信號通路，如MC1R/α-MSH信號通路、cAMP信號通路等，在黑色素合成過程中起著核心的調控作用［29］。本研究選取紅斑馬魚第二號外顯子作為敲除靶向序列，通過CRISPR/Cas9基因敲除技術構建了mitfa基因敲除體系。顯微注射紅斑馬魚胚胎發現，相較于正常紅斑馬魚，皮膚背部黑色素細胞明顯減少，這表明在紅斑馬魚中，mitfa仍然是控制黑色素細胞發育的主要調控基因，mitfa的敲除會導致黑色素細胞的減少、消退，而mitfa的敲除對黃色素細胞以及虹彩細胞造成的影響并不明顯。Jessica等［38］對小鼠的MITF的亞型MITFA進行了基因編輯，發現mitfa的缺失對于小鼠的毛色產生的影響不顯著，但還是會引起細微的變化，通過定量分析顯示mitfa缺失的小鼠突變體其毛色中黑色素細胞的積累減少了7%，這說明mitfa對黑色素的調節作用在小鼠中也有一定的效果，但作用相對較弱。Wang等［39］做了關于斗魚的mitfa基因的敲除，通過野生型斗魚與突變型比較發現，mitfa的缺失也同樣導致斗魚黑色素細胞的明顯減少。Jao等［40］利用CRISPR/Cas9技術進行了mitfa和tyr基因的雙敲除，獲得了位點雙突變的試驗魚，與野生型斑馬魚相比，試驗組斑馬魚整體黑色素細胞銳減。這些結果與紅斑馬魚mitfa基因敲除結果基本一致，且調節作用顯著，這表明mitfa基因是黑色素調控的關鍵基因，在兩種斑馬魚體色中具有同樣的調節功能。本研究再次驗證了mitfa對黑色素細胞的生長發育的正向調控作用，同時也為研究該基因在早期胚胎發育中的作用奠定了基礎。另外，優化后的CRISPR/Cas9敲除技術為進行紅斑馬魚基因的定向編輯提供了穩定的平臺。