轉化生長因子-β的理化性質及其分子結構的分析

張 敏，程 琰，賈沛洲，杜葉平，馬永峰，李 玲*

（1. 聯勤保障部隊第九八五醫院檢驗科，太原 030001；2. 聯勤保障部隊第九八零醫院基礎醫學實驗室，石家莊 050000）

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號傳導在癌癥進展中具有關鍵作用。大多數癌細胞可以促使它們的上皮抗增殖反應失活，并影響基因的表達、免疫抑制細胞因子的釋放和上皮可塑性，這些均得益于TGF-β的表達上調和自分泌TGF-β信號傳導［1］。腫瘤微環境中癌細胞、基質成纖維細胞和其他細胞釋放的TGF-β通過塑造腫瘤結構和抑制免疫細胞的抗腫瘤活性進一步促進癌癥的進展，從而產生免疫抑制環境，阻止或減弱抗癌免疫療法的療效。TGF-β在多種細胞類型中可以誘導上皮間質轉化（mesenchymal transition，EMT），包括乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等［1-2］。研究表明，將TGF-β的Ⅱ型受體（type II receptor，TβRII）轉染到高度轉移的小鼠結直腸癌細胞中會減弱TGF-β誘導的EMT和癌細胞的擴散，因此該結果表明，靶向TGF-β信號轉導是一種很有前景的癌癥治療策略［3］。除了對腫瘤發展的影響外，TGF-β誘導的EMT還可以促進許多器官的組織纖維化，如肺［4］和肝［5］。組織纖維化是持續炎癥后過量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積的結果，最終會導致器官衰竭。對纖維化病理過程的研究顯示，ECM的過量產生和組織硬度的增加與促進細胞生長、存活和促進遷移有關［6-7］。研究表明，由癌細胞本身驅動的癌癥相關成纖維細胞 （cancer-associated fibroblasts，CAF）可以促進腫瘤的生長，并被證明是腫瘤侵襲的驅動因素［8-9］。組織纖維化和腫瘤發生的機制是密不可分的，并且TGF-β信號在這兩種病理狀況中都起著至關重要的作用，因此可以將TGF-β信號通路作為癌癥和纖維化治療的靶點。

生物信息學是一門新興的學科，該學科主要從核酸和蛋白質出發，利用生物學軟件分析核酸的序列信息以及蛋白的理化性質、空間結構等。因此，本研究應用多種生物學工具對人TGF-β的理化性質、結構及功能等進行分析，為尋找新的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 TGF-β序列的獲得

以“TGF-β+Homo sapiens”為關鍵詞，從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫［10］（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載得到人TGF-β的氨基酸序列信息，其GenBank登錄號為AAA36738.1。

1.2 TGF-β的理化性質分析

通過軟件ProtParam［11］（http://web.expasy.org/protparam/）對TGF-β的理化性質進行分析。通過軟件Protscale［11］（http://web.expasy.org/protscale/）對TGF-β的親疏水性進行分析。

1.3 TGF-β的信號肽結構分析

通過軟件SignalP-5.0［12］（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對TGF-β的信號肽結構進行分析。

1.4 TGF-β的跨膜結構分析

通過軟件TMHMM-2.0［13］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）對TGF-β的跨膜區域進行分析。

1.5 TGF-β亞細胞定位分析

通過軟件PSORT Ⅱ［13］（https://psort.hgc.jp/form2.html）對TGF-β的亞細胞定位情況進行分析。

1.6 TGF-β二級結構和結構域分析

通過軟件SOPMA［14］（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對TGF-β的二級結構進行分析。用NCBI中的Conserved Domain數據庫分析TGF-β的結構域。

1.7 TGF-β蛋白翻譯后位點修飾

通過軟件NetNGlyc-1.0［15］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）對TGF-β的N-糖基化位點進行分析；通過軟件NetOGlyc-4.0［16］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0）對TGF-β的O-糖基化位點進行分析；通過軟件Netphos-3.1［17］（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）對TGF-β的磷酸化位點進行分析。

1.8 TGF-β與腫瘤的相關性分析

利用GEPIA（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）［18］在線網站分析TGF-β在腫瘤中表達量的變化情況以及與臨床預后的相關性。

2 結果與分析

2.1 TGF-β的理化性質分析

用ProtParam工具對TGF-β的理化性質進行分析，結果表明，該蛋白由431個氨基酸殘基組成，分子量為49 312.95 Da，分子式為C2203H3375N629O629S18，理論等電點為7.74。組成TGF-β的氨基酸有20種，其中異亮氨酸的含量最高，占總氨基酸的9.3%，色氨酸的含量最少，只有1.4%（圖1）。帶負電荷的殘基總數為46，帶正電荷的殘基總數為47，不穩定指數為53.82，親水性平均總值為-0.397，脂肪指數為76.96。

圖1 TGF-β的氨基酸組成分析Fig. 1 Analysis of amino acid composition of TGF-β

用ProtScale工具分析TGF-β的親疏水性，結果顯示，疏水性區大于親水性區。TGF-β氨基酸序列的第19位甘氨酸的疏水性最大，分值為2.167；第53位酪氨酸的親水性最大，分值為-3.233（圖2）。

圖2 TGF-β的親水性與疏水性分析Fig. 2 Hydrophilic-hydrophobic analysis of TGF-β

2.2 TGF-β的信號肽結構分析

用SignalP-5.0工具分析TGF-β的信號肽結構，結果顯示，存在信號肽的概率為82.51%，且信號肽可能的切割位點為第29和30位氨基酸之間（圖3）。

圖3 TGF-β的信號肽分析Fig. 3 Signal peptides analysis of TGF-β

2.3 TGF-β的跨膜結構分析

用TMHMM-2.0工具對TGF-β的跨膜結構進行分析，結果表明TGF-β有431個氨基酸序列，均位于膜外區，可知其為胞外蛋白，不存在跨膜區（圖4）。

圖4 TGF-β跨膜結構分析Fig. 4 Trans-membrane domain analysis of TGF-β

2.4 TGF-β的亞細胞定位

用PSORT Ⅱ工具進行亞細胞定位分析，結果表明，TGF-β定位于不同細胞器的可能性分別為：細胞外基質（66.7%）、內質網（22.2%）和液泡（11.1%）。

2.5 TGF-β二級結構和高級結構分析

用SOPMA工具對TGF-β的二級結構及各成分所占比例進行分析，結果顯示，TGF-β由23.49%的α螺旋（圖5中藍線）、18.37%的延伸鏈（圖5中紅線）、2.33%的β轉角（圖5中綠線）和55.81%的無規則卷曲（圖5中紫線）組成。保守結構域分析顯示，TGF-β屬于TGF-β_前肽和TGF-β_SF 超家族，該結構域分別由246和107個氨基酸殘基組成（圖6）。

圖5 TGF-β的二級結構分析Fig. 5 Secondary structure analysis of TGF-β

圖6 TGF-β功能結構域分析Fig. 6 Functional domain analysis of TGF-β

2.6 TGF-β翻譯后位點修飾

用NetNGlyc-1.0、NetOGlyc-4.0和Netphos-3.1工具分別對TGF-β翻譯后的N-糖基化、O-糖基化和磷酸化位點進行預測分析，結果表明，TGF-β的N-糖基化位點分別位于第187、302、321和372位的氨基酸，O-糖基化位點分別位于第78、104、112、113、120、290、293、294、296、300、304、306、322、323和324位的氨基酸。磷酸化位點的預測結果顯示，TGF-β分別具有21個絲氨酸位點、8個蘇氨酸位點和3個酪氨酸位點（圖7）。

圖7 TGF-β磷酸化位點的預測分析Fig. 7 Predictive analysis of TGF-β phosphorylation sites

2.7 TGF-β與腫瘤相關性的分析

GEPIA中囊括了33種腫瘤的測序數據，對TGF-β的表達量分析顯示，TGF-β在多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、頭頸部鱗狀細胞癌（head-and-neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腦低級別膠質瘤（brain lower grade glioma，LGG）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）和胃腺癌（stomach adenocarcinoma， STAD）中高表達，在腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、胸腺瘤（thymoma，THYM）和子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中低表達（P＜0.05）（圖8）。對TGF-β的預后分析顯示，TGF-β高表達與LGG和STAD患者的預后不良密切相關（P＜0.05）（圖9）。

圖8 TGF-β在腫瘤中表達量變化分析Fig. 8 Analysis of TGF-β expression in tumor

圖9 TGF-β的預后分析Fig. 9 Prognostic analysis of TGF-β

3 討論

本研究利用生物信息學在線軟件庫，對TGF-β基因所編碼的蛋白質結果與功能進行了預測分析。結果表明：TGF-β是一種堿性、不穩定的疏水性蛋白，組成所需的氨基酸有20種，其中異亮氨酸的含量最多（9.3%）；TGF-β具有信號肽序列，是經典的分泌蛋白，沒有跨膜結構域，屬于胞外蛋白，其二級結構主要是無規則卷曲；TGF-β結構域的分析顯示，其屬于TGF-β_前肽和TGF-β_SF 超家族；TGF-β超家族包含30多個成員，這些成員參與多種生理過程，包括胚胎發育、增殖、分化、凋亡和免疫反應［1］

蛋白質在細胞內合成后需要運輸到特定的亞細胞結構才能發揮其功能。對TGF-β的亞細胞定位分析顯示，其定位于不同細胞器的可能性分別為：細胞外基質（66.7%）、內質網（22.2%）和液泡（11.1%）。本研究發現，TGF-β是胞外蛋白且具有信號肽結構，這表明其是經典的分泌性蛋白，并且主要在細胞外基質中發揮功能。

聚糖是覆蓋細胞表面的糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和糖脂的一部分，它們在不同的生物和細胞功能中發揮著關鍵作用。蛋白質糖基化包括N-連接糖基化［其中聚糖與蛋白質的天冬酰胺（Asn）殘基的氮相連］、O-連接糖基化［其中聚糖與絲氨酸 （Ser） 或蘇氨酸 （Thr）殘基相連］和C-甘露糖基化［其中甘露糖與蛋白質的色氨酸（Trp）相連］等。蛋白糖基化的異常修飾與多種發育障礙和腫瘤進展有關［19-20］。其中在肺纖維化中，可以通過取代TGF-β的N-糖基化位點，進而抑制TGF-β的激活，從而導致細胞黏附性的喪失［21］。此次研究對TGF-β翻譯后糖基化位點的預測分析結果顯示，其具有4個N-糖基化和15個O-糖基化位點。目前，糖蛋白是臨床上最常用的癌癥生物標志物和藥物靶向作用位點，因此，本研究對TGF-β翻譯后糖基化位點的預測分析也為肺纖維化等疾病提供新的治療思路。

磷酸化修飾是真核生物蛋白質翻譯后廣泛存在的重要修飾方式，其能夠調控信號傳導、基因表達、細胞周期等諸多細胞過程。當這種修飾發生異常時，常常與疾病的發生有著密切的關聯［22］。哺乳動物中TGF-β具有3種亞型，即TGF-β1、β2和β3，由不同的基因編碼，但通過相同的信號系統發揮作用［23］。TGF-β家族成員通常以無活性的潛伏形式分泌并沉積在ECM中，需要經過蛋白水解過程來產生活性配體。二聚體TGF-β通過與TβRII絲氨酸/蘇氨酸激酶結合并隨后在質膜中募集I型受體（TβRI）來發揮其功能，與TβRII結合后，TβRI隨后被TβRII磷酸化，TβRII通過SMAD 2/3蛋白的磷酸化傳遞信號［24］。磷酸化可以促使SMAD 2/3與SMAD 4蛋白形成異聚復合物并轉移到細胞核中。SMAD復合物通過與轉錄因子結合，調節靶基因的表達。研究表明，抑制TGF-β和SMAD 2/3時，可以抑制垂體腺瘤和肺癌的細胞生長［25-26］。此外，抑制TGF-β的磷酸化可以降低胃癌的侵襲能力［27］。在臨床上，TGF-β受體激酶的小分子抑制劑（small-molecule inhibitors，SMI）更受歡迎，因為它們經濟、易于生產、穩定，并且可以通過口服給藥［24］。這些抑制劑是ATP類似物，旨在通過阻斷TβRI的激酶活性位點來特異性抑制R-SMAD磷酸化。代表性的SMI有SB431542、SB505124、LY2157299和LY550410等［28］。本研究分析結果顯示，TGF-β分別具有21個絲氨酸位點、8個蘇氨酸位點和3個酪氨酸位點。TGF-β的磷酸化修飾涉及到其調控細胞增殖、細胞凋亡、細胞免疫等許多生物過程，對生命體有著重要的作用。這些磷酸化位點可能是潛在的臨床治療靶點。這也為研究TGF-β在細胞生理活動中的功能及機制提供了參考依據。

對TGF-β與腫瘤的相關性分析顯示，TGF-β在GBM、HNSC、KIRC、LGG、PAAD和STAD中高表達，在ACC、THYM和UCEC中低表達。在腫瘤發展過程中，腫瘤細胞不斷與周圍的微環境進行通信，從而引導腫瘤細胞進行EMT。EMT被認為是促進腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟，本研究中TGF-β的表達量變化往往與其發揮著的重要功能密切相關。例如，WNT/TGF-β的高表達在HNSC［29］中抑制M1型巨噬細胞的激活，進而促進腫瘤細胞的EMT。FUBP1通過抑制TGF-β/SMAD在PAAD中的表達，從而抑制了腫瘤細胞的侵襲能力［30］。對TGF-β的預后分析顯示，TGF-β高表達與LGG和STAD患者的預后不良密切相關。生存率是一個評價癌癥治療效果的重要指標，其中腫瘤細胞的轉移是導致預后不良的重要生物學特征。TGF-β的高表達導致患者的生存率顯著下降，因此，在臨床上可以通過檢測TGF-β的表達量變化，進而達到預測LGG和STAD患者預后的變化情況。

總之，本研究利用生物信息學的方法對TGF-β的理化性質、蛋白結構以及與腫瘤的相關性進行了分析。結果表明，TGF-β是一種堿性、不穩定的疏水性蛋白，具有信號肽且主要在細胞外基質發揮作用。此外，TGF-β在多種腫瘤中高表達并且與腫瘤的轉移和不良預后密切相關。這些結果將對進一步研究TGF-β在生命活動中的作用機制提供新的思路和依據。