添加漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響研究

石 杰， 宋淑敏，魏連會(huì)，董 艷，楊慶麗

（黑龍江省科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

啤酒酵母是啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的常用酵母，不但可以用于釀造啤酒，由于其菌體營(yíng)養(yǎng)豐富，還可以提取維生素、細(xì)胞色素 C、核酸、谷胱甘肽、凝血質(zhì)、輔酶 A 和三磷酸腺苷等[1-3]，從而用于藥膳及飼料[4]，成為新時(shí)期保健食品研制的熱點(diǎn)話(huà)題。在啤酒酵母的培養(yǎng)過(guò)程中，氮源的含量、組成及種類(lèi)能夠顯著影響酵母細(xì)胞的組成和關(guān)鍵物質(zhì)的合成途徑[5-6]。在釀制啤酒過(guò)程中，添加氮源種類(lèi)和含量不同不但對(duì)啤酒的發(fā)酵度有顯著影響，同時(shí)對(duì)成品啤酒的理化性質(zhì)及風(fēng)味也起著主導(dǎo)作用[7-9]。為提高啤酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中的生物量及發(fā)酵速率，增加啤酒發(fā)酵成品中的營(yíng)養(yǎng)成分，補(bǔ)充氮源成為一種可行的有效辦法[10]。

漢麻 （CannabisSativaL） 在我國(guó)有著悠久的種植歷史，漢麻籽富含優(yōu)質(zhì)蛋白[11-12]及合理的必需氨基酸和非必需氨基酸比例，特別是含有大量人體代謝需要的精氨酸，不含致敏因子，不會(huì)造成胃脹、反胃和過(guò)敏反應(yīng)[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)，漢麻籽多肽具有很好的抗氧化性能和降血脂作用[15-16]。因此，將漢麻籽多肽作為補(bǔ)充氮源，研究一株購(gòu)自日本的啤酒酵母在 添 加 漢 麻 籽 多 肽 前 后 的 生 長(zhǎng) 變 化 ， 為 提 高 啤 酒 酵母生產(chǎn)效率、加速啤酒釀造提出一條新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1） 漢麻籽多肽。課題組自行研制 （<5 000 amu）；啤酒酵母、大麥芽、啤酒花，日本新瀉麥酒株式會(huì)社提供。

（2） 麥芽汁培養(yǎng)基。蛋白胨 4 g，葡萄糖 10 g，酵母浸粉 3 g，麥芽浸粉 10 g，瓊脂粉 18 g （固體），蒸餾水 1 000 mL，于 121 ℃下滅菌 30 min。

（3） YEPD 培養(yǎng)基。酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g溶解于 900 mL 蒸餾水中 （固體培養(yǎng)基中另加入瓊脂粉 18 g）；另取 20 g 葡萄糖溶于 100 mL 蒸餾水中；分別于 121 ℃下滅菌 30 min；使用前于無(wú)菌環(huán)境下混合。

鹽酸，氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28-Standard 型 pH 計(jì)，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；UV759S 型紫外 - 可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BK5000 型生物顯微鏡，OPTEC 奧特光學(xué)產(chǎn)品；HPX-9082 MBE 型恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；DHG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同添加量漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響

在 YEPD 培養(yǎng)基 （除葡萄糖溶液） 中將總體積占比 0.5%和 1%添加量的漢麻籽多肽粉滅菌，接種酵母前于無(wú)菌環(huán)境中按比例混合已滅菌葡萄糖溶液，同時(shí)制備對(duì)照培養(yǎng)基并滅菌。各處理接種已培養(yǎng) 24 h 的啤酒酵母種子培養(yǎng)液 1 mL，于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃培養(yǎng) 24 h 后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)、菌體干重測(cè)定和顯微鏡鏡檢。

（1） 菌體干重測(cè)定。取各處理 10 mL 菌懸液，以轉(zhuǎn)速 4 000 r/min 離心 20 min，棄上清液，加入10 mL蒸餾水重懸酵母，再次以轉(zhuǎn)速 4 000 r/min 離心 20 min，棄去上清液，105 ℃下烘干 3 h，稱(chēng)得菌體干重。

（2） 顯微鏡鏡檢。為方便觀察和拍照，固定菌體后進(jìn)行了結(jié)晶紫染色。

1.3.2 添加漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

麥芽汁液體培養(yǎng)基共準(zhǔn)備 48 瓶，每瓶 50 mL，其中 24 瓶中分別添加總體積占比 0.5%添加量的漢麻籽多肽粉。滅菌后 48 瓶同時(shí)接種已培養(yǎng) 24 h 的啤酒酵母種子培養(yǎng)液 100 μL，28 ℃，以轉(zhuǎn)速 180 r/min搖瓶培養(yǎng)。以原始培養(yǎng)基為零標(biāo)，采用分光光度計(jì)分別檢測(cè) 2 種培養(yǎng)基 3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36 h 時(shí)的 OD600值，建立生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.3 漢麻籽多肽精釀啤酒工藝流程

粉碎大麥芽→糖化→煮沸→過(guò)濾→冷卻→接種啤酒酵母→主發(fā)酵→后熟→成品。

1.3.4 操作要點(diǎn)

（1） 糖化。粉碎大麥芽 100 g 加入蒸餾水 500 mL，加熱至 65 ℃持續(xù) 90 min，繼續(xù)加熱至 80 ℃持續(xù)30 min。

（2） 煮沸。添加 1 g 啤酒花，將糖化好的麥汁煮沸 30 min。

（3） 冷卻。過(guò)濾后室溫冷卻至 30 ℃。

（4） 接種啤酒酵母。直接將培養(yǎng)好的啤酒酵母平板中的啤酒酵母刮取后混入冷卻液 （1 盤(pán) / 100 mL）。

（5） 主發(fā)酵。發(fā)酵溫度 8～20 ℃，發(fā)酵 7 d。

（6） 后熟。主發(fā)酵后將發(fā)酵液置于 6 ℃冷藏室15 d，去除酵母和沉淀物，得到漢麻籽多肽精釀啤酒。

1.3.5 漢麻籽多肽精釀啤酒中啤酒酵母活菌數(shù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以精釀啤酒后熟的酵母活菌數(shù)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)主發(fā)酵溫度 （A）、漢麻籽多肽添加量 （B） 和漢麻籽多肽添加時(shí)期 （C） 進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究提高酵母活菌數(shù)的條件組合。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒酵母序列鑒定

采用提取 DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR 后測(cè)序的方法進(jìn)行了啤酒酵母菌種的鑒定，測(cè)序結(jié)果如下：

試驗(yàn)結(jié)果中該菌株被鑒定為Saccharomyces（酵母 菌 屬）， 為Saccharomycescerevisiae（啤 酒 酵 母）。確定菌種后即可進(jìn)行其他相關(guān)研究。

2.2 不同添加量漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響

不同添加量的漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)及菌干重見(jiàn)表 2。

表2 不同添加量的漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)及菌干重

由 表 2 可 知 ， 在 YEPD 培 養(yǎng) 基 中 添 加 0.5% 和1%含量的漢麻籽多肽均可以增加培養(yǎng)基中酵母菌的活菌數(shù)和菌干重。其中，添加量 1%的漢麻籽多肽可以提高活菌數(shù) 18.67%，添加量為 0.5%的漢麻籽多肽可以提高菌干重 11.12%。而添加量為 1%的漢麻籽多肽對(duì)酵母菌干重的增加量少于添加量為 0.5%的漢麻籽多肽，說(shuō)明添加過(guò)多漢麻籽多肽僅僅可能增加啤酒酵母活菌數(shù)，不能增加酵母菌干重。

不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基中酵母菌的形態(tài)見(jiàn)圖 1。

圖1 不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基中酵母菌的形態(tài)

由圖 1 可知，沒(méi)有添加漢麻籽多肽和添加量為0.5%漢麻籽多肽 YEPD 培養(yǎng)基中的啤酒酵母平均直徑要大于添加 1%漢麻籽多肽的 YEPD 培養(yǎng)基中的啤酒酵母。同樣證明了添加過(guò)量漢麻籽多肽僅對(duì)增加啤酒酵母的數(shù)量有益，對(duì)啤酒酵母的干重增加影響不大。

不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母后的狀態(tài)見(jiàn)圖 2。

在 YEPD 培養(yǎng)基中添加 0.5%和 1%漢麻籽多肽后，培養(yǎng)基的顏色與對(duì)照是相同的，由圖 2 可知，隨著漢麻籽多肽添加量的增加，培養(yǎng)啤酒酵母后培養(yǎng)基的顏色越深。可能是因?yàn)槠【平湍笖?shù)量隨著漢麻籽多肽添加量的增加而增加，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)被利用，同時(shí)產(chǎn)生了大量深色代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基的顏色加深。具體產(chǎn)生了哪些代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基顏色加深還需要進(jìn)一步研究。

圖2 不同漢麻籽多肽添加量的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母后的狀態(tài)

2.3 添加漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

啤酒酵母在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖 3。

圖3 啤酒酵母在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖 3 可知，添加漢麻籽多肽的麥芽汁培養(yǎng)基與普通麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。二者的趨勢(shì)一致，均在 6 h 后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，并在 15 h 開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。指數(shù)生長(zhǎng)后期，12 h 左右漢麻籽多肽麥芽汁培養(yǎng)基中酵母數(shù)量即超過(guò)了普通麥芽汁培養(yǎng)基中的酵母數(shù)量，并一直持續(xù)至 36 h。這與 2.2 的研究結(jié)果相一致。

2.4 漢麻籽多 肽 添加量、添加時(shí)期 及 主發(fā) 酵 溫 度對(duì)啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果對(duì)主發(fā)酵溫度 （A）、漢麻籽多肽添加量 （B） 和漢麻籽多肽添加時(shí)期 （C） 3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討對(duì)啤酒酵母活菌數(shù)影響最大的變量。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3。

由表 3 可知，影響啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的各因素主次關(guān)系為A>B>C，其中主發(fā)酵溫度對(duì)精釀啤酒中啤酒酵母的數(shù)量影響顯著，其次是漢麻籽多肽的添加量。得出提高精釀啤酒活菌數(shù)量的最佳條件為A1B2C3，即主發(fā)酵溫度為 8 ℃，漢麻籽多肽添加量為 0.5%，并在主發(fā)酵后添加。添加了漢麻籽多肽的精釀啤酒呈黃棕色，較普通啤酒顏色更深，但口感細(xì)膩醇厚、香氣獨(dú)特。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

添加 0.5%或 1%的漢麻籽多肽都可以提高 YEPD培養(yǎng)基中啤酒酵母的活菌數(shù)和菌干重，且漢麻籽多肽添加量越多，啤酒酵母活菌數(shù)越高，過(guò)多漢麻籽多肽不能再增加啤酒酵母的菌干重，說(shuō)明添加漢麻籽多肽可以提高啤酒酵母的裂殖活性，但由于碳源或其他營(yíng)養(yǎng)因素的限制，不能提高啤酒酵母的菌干重，鏡檢結(jié)果也說(shuō)明了同樣的問(wèn)題。添加和不添加漢麻籽多肽的麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)是相似的，但指數(shù)生長(zhǎng)后期漢麻籽多肽麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母數(shù)量要高于普通麥芽汁培養(yǎng)基中啤酒酵母數(shù)量。

影響啤酒酵母在精釀啤酒中活菌數(shù)量的各因素主次關(guān)系為主發(fā)酵溫度 > 漢麻籽多肽添加量 > 漢麻籽多肽添加時(shí)期，提高精釀啤酒活菌數(shù)量的最佳條件為主發(fā)酵溫度 8 ℃，漢麻籽多肽添加量 0.5%，并在主發(fā)酵后添加。可能是添加了適量的漢麻籽多肽補(bǔ)充了主發(fā)酵后啤酒酵母增殖所需要的氮源，在后熟過(guò)程中又促進(jìn)了酵母的增殖。因此，添加漢麻籽多肽對(duì)啤酒酵母的增殖具有重要意義，是一種提高啤酒酵母生產(chǎn)效率、提高啤酒品質(zhì)的一條重要途徑。