異硫氰酸芐酯對于黃曲霉生長速率和產毒情況的影響

程 月 朱姍姍 劉 靜 張世凱 翟曉松 劉 陽 趙月菊,*

(1 中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2 山東農業大學食品與科學工程學院，山東 泰安 271018)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種腐生真菌，易污染各類農產品，同時會產生具有強毒性和強致癌性的黃曲霉毒素(aflatoxins, AFT)，嚴重威脅人畜健康[1-4]。花生和玉米在種植、儲藏和加工中受黃曲霉毒素污染嚴重，黃曲霉毒素污染超標事件時有發生。馬皎潔等[5]對來自湖南和湖北等12個省的玉米及其制品共計650份樣品進行了真菌毒素檢測，結果發現,玉米黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的檢出率為53.02%，且有10.53%的玉米樣品中AFT含量超出國家標準。高秀芬等[6]調查全國主要花生和玉米產區的AFT污染情況發現，6個產區的花生AFB1污染率較嚴重，污染率接近60%，AFB1污染平均含量為91.74 μg·kg-1；在全國6個省抽取279份玉米樣品，AFB1檢出率高達75.63%，在抽檢的七類食品中，花生、玉米的檢出率最高[7]。2015年在我國農產品出口歐盟的251個違例事件中，花生中的AFT超標事件高達98起，占39.0%，2014年違例事件167起，其中花生AFT超標事件36起，占21.6%[7]。AFT污染給我國農產品加工和出口造成了巨大的經濟損失。目前主要通過抑制黃曲霉菌的生長和毒素的形成來解決AFT污染。其中應用防霉劑是控制黃曲霉毒素污染的一種有效方式，通常采用的防霉劑主要是人工合成類殺菌劑，如咪唑類，雖然效果良好，但具有毒副作用、易殘留、降解周期長等缺點，限制了這類殺菌劑的使用范圍及劑量[8-10]。因此，亟待開發新型安全無殘留的防霉殺菌劑，從而有效控制黃曲霉污染。

異硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)是一類具有R-N=S結構通式的化合物，是硫代葡萄糖苷(benzyl glucosinolate, BG)的酶解產物，天然存在于十字花科、番木瓜科植物中，例如蘿卜、花椰菜、薺菜等[11]。異硫氰酸芐酯(benzyl isothiocyanate, BITC)是指R基團為芐基的一種異硫氰酸酯。BITC已被證明是安全無毒的，廣泛用于降低血糖、血脂和抗癌[12]。Azaiez等[13]通過體外試驗驗證了3種異硫氰酸酯對真菌的抑制作用，發現3種異硫氰酸酯可以作為天然防腐劑應用在面包或易受串珠鐮刀菌污染的食品中。Mejia-Garibay等[14]在液體培養和熏蒸條件下發現了黑芥末精油(異硫氰酸烯丙酯為其主要成分)可以抑制黃曲霉的活性。水分活度(water activity，aw)是影響霉菌生長與產毒的關鍵因素，但是目前關于aw對BITC抑制黃曲霉效果的影響鮮有報道。因此，本試驗分別以花生和玉米為培養基質，研究不同濃度BITC在不同aw下對于黃曲霉生長和產毒情況的影響，旨在為進一步開發基于BITC的抑菌產品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A.flavusNRRL3357，由中國科學院微生物研究所提供；AFB1，美國西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；BITC，上海源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1260型高效液相色譜儀(配有AgilenTTC-C185 μm×4.6 μm×250 mm色譜柱)，美國安捷倫科技有限公司；LRH-150F型生化培養箱，廣州番禹旭東坂田電子有限公司；SZ2-1LST型電子顯微鏡，日本Olympus公司；DRP-9052型電熱恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海森信實驗儀器有限公司；D10-12型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；BSA124S型電子天平，德國Sartorius公司；Aqualab 4TE水活度測定儀，美國Decagon Devices公司；光化學衍生器，北京華安邁克生物有限公司；SK06G超聲波清洗器，上海可導超聲儀器有限公司。

1.3 培養基

玉米培養基：稱取40 g玉米，碾碎成粉末后加入甘油和去離子水定容至1 000 mL，通過調節甘油和去離子水的添加比例控制培養基水分活度為0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g瓊脂粉，121℃高壓滅菌30 min。

花生培養基：稱取40 g花生，碾碎成粉末后加入甘油和去離子水定容至1 000 mL，通過調節甘油和去離子水的添加比例控制培養基水分活度為0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g瓊脂粉，121℃高壓滅菌30 min。

自制馬鈴薯培養基(potato dextrose agar，PDA)：200 g去皮馬鈴薯煮沸30 min，紗布過濾固體物質取濾液，加入20 g葡萄糖和16 g瓊脂粉，用蒸餾水定容至1 000 mL，115℃高壓滅菌30 min。

1.4 孢子菌懸液的配制

將甘油保藏的黃曲霉菌株接種到PDA培養基上，放置在28℃生化恒溫培養箱中培養5 d，待培養基表面長滿黃曲霉綠色菌絲后，取出培養基，在PDA培養基上加入1 mL 0.1%吐溫80溶液，使用無菌棉簽挑取黃曲霉孢子至1%吐溫80溶液制成均勻的孢子菌懸液中，用血球平板計數，調至濃度107CFU·mL-1待用。

1.5 BITC溶液的配制

將BITC溶于乙醇，采用梯度稀釋法配制所需溶液[16]。

1.6 BITC抑制黃曲霉效果的分析

將黃曲霉孢子懸液接種于花生培養基中央，平板倒置，將一無菌圓形濾紙片(直徑20 mm)貼在另一平板中央，取一定量的BITC配制溶液于濾紙片上，使花生培養基平板內精油濃度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1，加入等量乙醇作為對照組。同樣的方法接種黃曲霉于玉米培養基，使其濃度為0、2.5、5.0 mg·L-1。然后用封口膜密封平板，28℃培養7 d后測量菌落直徑，直徑反映了菌絲生長速率。BITC的體外抑菌效果分別采用菌落直徑和抑菌率來表示。抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)，每個處理3個重復。

抑菌率與菌落直徑的換算公式為：

(1)。

1.7 AFB1的提取和檢測

抑菌效果測定后，提取黃曲霉毒素。取培養基平板，用6 mm打孔器分別從中心、外緣和中間部位打3個菌餅置于5 mL離心管，加入1.5 mL氯仿，震蕩30 min后8 000 r·min-1離心10 min取下層液體，60℃氮吹，用1 mL甲醇復溶。復溶之后的溶液用0.22 μm濾膜過濾到棕色液相進樣瓶中，直接上樣。

高效液相色譜分析條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；熒光檢測器2475型，激發波長360 nm，發射波長：440 nm；柱溫：30℃；流動相：以甲醇∶水(7∶3, v∶v)為流動相；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1[17]。

(2)。

1.8 掃描電鏡觀察BITC對黃曲霉菌絲形態變化的影響

取aw為0.98的花生培養基中BITC(10 mg·L-1)處理3 d的黃曲霉菌絲和對照菌絲，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，濃度為50%、75%、100%的乙醇各脫水20 min。通過臨界點干燥法干燥樣品，進行噴金處理[18]。掃描電鏡下觀察并拍照。

1.9 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0方差分析(ANOVA)分析試驗數據，使用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)進行顯著性分析(P<0.05)；采用 Origin Pro 2017C 64Bit軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 BITC對黃曲霉生長速率的影響

2.1.1 BITC在不同aw對黃曲霉生長速率的影響 (以花生為培養基質) 黃曲霉等曲霉屬絲狀在適宜的固體培養基表面常形成肉眼可見的菌落，并產生大量孢子，通過傳播擴散進一步生長繁殖。由圖1可知，在同一aw下(除0.930外)，BITC濃度不同，黃曲霉生長速率差異顯著(P<0.05)。在設置的4個aw下，黃曲霉的生長速率均隨著BITC濃度的增大而減小，且aw降低也會抑制黃曲霉的生長。當花生培養基質aw為0.930時，BITC對黃曲霉的MIC值最小(5 mg·L-1)。表明以花生為培養基質，BITC具有抑制和減弱黃曲霉菌絲徑向生長和菌落形成的能力，并且具有明顯的濃度-效應和水分活度-效應關系。

注：同一水分活度下，不同字母代表不同濃度BITC 之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: For the same water activity, different letters represent significant differences between differenTConcentrations of BITC (P<0.05). The same as following.圖1 以花生為培養基質，BITC對不同水分活度下 黃曲霉生長速率的影響Fig.1 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.1.2 BITC濃度在不同aw下對黃曲霉生長速率的影響 (以玉米為培養基基質) 由圖2可知，同一aw下BITC處理濃度不同，黃曲霉的生長速率有顯著差異(P<0.05)。在4個水分活度下，黃曲霉的生長速率均隨著BITC處理濃度的增大而減小。在BITC未處理的玉米培養基質中，黃曲霉的生長速率隨水分活度的降低而減小，在培養基質aw為0.930時，BITC對于黃曲霉有較好的抑菌效果，其MIC值為2.5 mg·L-1。表明以玉米為培養基質，BITC具有顯著影響黃曲霉徑向生長和菌落形成的作用，并且具有明顯的濃度-效應和水分活度-效應關系。

圖2 以玉米為培養基質，BITC對不同水分活度下 黃曲霉生長速率的影響Fig.2 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with maize as the medium substrate

2.2 aw和培養基基質對BITC抑制率的影響

2.2.1 aw對于BITC抑制率的影響 (以花生為培養基質) 由表1可知，不同aw對BITC抑制黃曲霉生長的抑制率有顯著差異(P<0.05)。aw越小，BITC對黃曲霉生長的抑制率越大。在5和10 mg·L-1BITC處理的花生培養基基質中，aw為0.930時可以完全抑制黃曲霉的生長；在15 mg·L-1BITC處理的基質中，aw為0.960時完全抑制黃曲霉的生長；而20 mg·L-1BITC處理的基質，aw為0.980時就可完全抑制黃曲霉的生長，黃曲霉的MIC值隨著水分活度的減小而減小。

2.2.2 培養基質對于BITC抑制率的影響 由表2可知，在5 mg·L-1BITC處理條件下，同一aw(0.960、0.980和0.995)下，不同培養基基質對BITC抑菌率有顯著影響(P<0.05)，以玉米為培養基基質BITC的抑菌率大于以花生為培養基基質。以花生和玉米為培養基基質完全抑制黃曲霉的生長的aw分別為0.930和0.995。

2.3 BITC對黃曲霉產毒的影響

2.3.1 BITC濃度和水分活度對黃曲霉產毒的影響 (以花生為培養基質) 由圖3可知，以花生為培養基基質，在較高aw(0.995和0.980)下，AFB1含量隨著BITC濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。而在較低aw(0.960和0.930)下，BITC濃度的增大會導致AFB1含量降低。并且隨著aw的降低，黃曲霉產毒被完全抑制所需的BITC濃度越來越低，aw為0.930時，BITC濃度僅需5 mg·L-1就可以完全抑制黃曲霉的產毒。當使用相同的BITC濃度時，aw降低會進一步抑制黃曲霉產毒。

表1 以花生為培養基基質，水分活度對不同BITC濃度抑制黃曲霉抑制率的影響Table 1 Effect of different aw on inhibition rate of A. flavus with peanut as the medium substrate /%

表2 5 mg·L-1 BITC處理條件下，培養基質對BITC 抑制黃曲霉抑制率的影響Table 2 Effect of medium substrate on inhibition rate of BITCAgainst A. flavus under 5 mg·L-1 BITC treatment /%

圖3 以花生為培養基質，不同濃度BITC在 不同水分活度下對于AFB1含量的影響Fig.3 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.3.2 BITC濃度和水分活度對于黃曲霉產毒的影響 (以玉米為培養基質) 由圖4可知，在同一aw下，黃曲霉產毒濃度隨著BITC濃度的增大而減小。在相同BITC濃度下，aw的減弱會進一步抑制黃曲霉毒素的產生。在aw為0.995、0.980和0.960時，BITC濃度在5 mg·L-1時其產毒被完全抑制；在aw為0.930時，BITC濃度在2.5 mg·L-1時可以完全抑制黃曲霉產毒。

圖4 以玉米為培養基質，BITC濃度在 不同水分活度下對于AFB1含量的影響Fig.4 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.4 BITC對黃曲霉菌絲形態變化的影響

由圖5-A、B可知，掃描電鏡下觀察到未添加黃曲霉的菌絲表面光滑、圓潤，呈桿狀，經BITC處理72 h后，黃曲霉的菌絲形態有明顯變化，菌絲表面有明顯破損并且有粘連趨勢。宏觀形態觀察結果表明，BITC處理可明顯抑制黃曲霉的生長(圖5-a、b)。

注：微觀形態：A為未用BITC處理的黃曲霉，B為使用BITC處理的黃曲霉；宏觀形態：a為未用BITC處理的黃曲霉，b為使用BITC處理的 黃曲霉。Note: Microscopic morphology: A: Aspergillus flavus without BITC treatment, B: Aspergillus flavus treated with BITC. Macroscopic morphology: a: Aspergillus flavus without BITC treatment, b: Aspergillus flavus treated with BITC.圖5 BITC對黃曲霉形態的影響Fig.5 Effect of BITC on the morphology of A. flavus

3 討論

目前國內外對BITC殺菌防霉作用的研究取得了一些進展，Isshiki等[19]測定了BITC抑制霉菌、細菌和酵母菌的生長情況，結果表明雖然其對各種病原微生物的抑制效果有差異，但都具有抑制作用。張建佳等[20]以微小枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為模式菌株，以未添加BITC為對照組，通過測定微生物的生長曲線，發現在不致死細菌的濃度下控制BITC的加入可以延長微生物的延滯期，并認為BITC對細菌生長有一定的抑制作用。本研究也證實了BITC對黃曲霉有良好的抑菌作用，且抑菌效果與其濃度呈正比。

此外，有研究表明黃曲霉的生長速率與基質的aw有關[21-22]。本研究也表明aw越低，BITC的抑菌活性越強，這可能是由于水分活度的降低會使培養基質內蒸氣壓升高，導致BITC的抑菌能力增強[23]。此外，本研究也證明了BITC在玉米培養基質中的抑菌活性比在花生培養基質中強，這可能是由于玉米中的糖含量高于高于花生，糖在基質中也可以作為一種防腐劑[24]，但是隨著aw的降低會弱化培養基基質對BITC抑菌性的影響。

另外，本研究結果還表明，低aw也會抑制黃曲霉產毒，這與Ahmed等[25]研究黃曲霉在其他培養基上的產毒情況一致。Antonia等[26]研究發現，黃曲霉在杏仁培養基中aw與黃曲霉的產毒成正比。此外，本研究在aw為0.995花生培養基質內用BITC熏蒸黃曲霉，其產毒呈現先上升后下降的趨勢。Sonia等[27]研究表明，玉米中牛蒡、玫瑰草和香茅、肉桂精油在高aw(0.995)下對于鐮刀菌產毒的抑制效果不明顯，甚至有促進產毒作用。這可能由于逆境中的微生物傾向于合成更多的次級代謝產物[28]。本研究中，BITC熏蒸可能造成了一個逆境環境，從而可能出現黃曲霉的產毒能力增加的現象。在較低aw下(0.980、0.960和0.930)的花生培養基質隨著BITC處理濃度的增加，黃曲霉的產毒能力下降。在以玉米為培養基基質時，BITC濃度的增加和水分活度的下降均會抑制黃曲霉產毒。

掃描電鏡觀察到菌絲形態受到嚴重破壞，發生了表面黏連、不平整、皺縮等一系列變形,這是由于BITC破壞了黃曲霉菌絲體細胞壁結構，使黃曲霉不能維持細胞固有形態，阻止菌絲體的生長[29]，其內在機制可能是BITC的強疏水性造成細胞膜流動性發生變化，從而導致細胞內滲透壓不平衡，抑制其酶促反應、內容物泄露，最后造成細胞膜破裂，細胞死亡[30]。

4 結論

本研究表明，BITC能夠顯著抑制黃曲霉的生長和產毒，同時具有濃度-效應、培養基-效應和水分活度-效應關系。BITC在培養基低aw時具有更強的抗菌活性，這為BITC增強抗菌活性提供了一種手段。在aw為0.930時，較花生培養基質，以玉米為培養基基質時黃曲霉可以取得較小的MIC值(2.5 mg·L-1)。當花生培養基質高aw(0.995，0.980)條件下，低BITC濃度會促進黃曲霉的產毒，這是投入使用BITC時需要注意的問題，也提示僅抑制黃曲霉的生長來控制黃曲霉的產毒是不科學的。