sRNA SaaS對沙門氏菌粘附響應規律和胞外代謝物的影響效應

何淑雯 胡海靜 陸許秋 王浩東 王虎虎 徐幸蓮

(南京農業大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心/江蘇省肉類生產與加工質量 安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種重要的食源性致病菌，在全球范圍內每年可造成大量的食品安全事件并造成食品行業巨大的經濟損失[1-2]。在食品加工過程中的接觸表面形成生物菌膜是沙門氏菌實現傳播和污染的重要途徑。生物菌膜是細菌粘附于接觸表面后，通過增殖和分泌物胞外多聚物而形成的具有一定空間結構的生物群體[3]。越來越多的證據表明，控制生物菌膜形成過程的分子網絡受到非編碼sRNA的調控。非編碼sRNA是一類在基因組中轉錄但不編碼蛋白質的RNA。目前，生物菌膜的形成在轉錄后水平的調控機制已成為食品安全的研究熱點，但現有調控通路仍不能完全解釋腸炎沙門氏菌的粘附過程。sRNA SaaS (Salmonellaadhesion associated sRNA) 是近期在肉品源腸炎沙門氏菌中篩選出的一種新型調控因子，結晶紫染色試驗結果顯示該sRNA能夠顯著抑制生物菌膜的形成，但其具體功能和調控路徑尚不清楚[4]。

生物菌膜的形成離不開物理接觸表面的存在，在食品生產和日常生活中，機械加工設備和不同材質食品盛裝器具的表面均可成為細菌粘附的載體。了解細菌在接觸表面的粘附響應規律對于理解粘附因子的具體功能具有指導意義。近年來，相關研究或多以不銹鋼作為接觸面材質加以展開[5-6]，或對環境溫度的設置較為單一[7-8]，而同時使用多種材質的接觸面并在多個溫度下進行觀測的研究相對較少。

胞外代謝物是生物菌膜的重要組成部分，解析胞外代謝物有助于更直觀有效地了解生物菌膜的形成過程及其機理。代謝組學通過對所有代謝物進行分析，提供代謝途徑中發生變化的關鍵信息，從而揭示生物體生命活動發生和發展的本質[9]。廣泛靶向代謝組學(widely-targeted metabolomics)結合了靶向代謝組學和非靶向代謝組學兩種傳統分析方法的優點，能夠利用基于多反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM)的四極桿-線性離子阱串聯質譜法(QTRAP)，對代謝物實現準確的鑒定和檢測[10]。近年來，代謝組學已廣泛運用到微生物領域[11-13]。

針對上述現象和問題，本研究以分離自肉品加工接觸面的腸炎沙門氏菌為試驗對象，使用前期成功構建的sRNA SaaS基因缺失突變株為試驗組，野生株為對照組，對浮游態和粘附態兩種生存形式的菌體展開試驗；通過研究細菌的粘附響應規律初步判定SaaS的作用條件；進一步利用廣泛靶向代謝組學方法對胞外代謝物進行分析，以期揭示SaaS對生物菌膜形成的分子機制提供線索，完善生物菌膜的理論體系，為研發生物菌膜新型控制技術提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase/tryptic soy broth，TSB)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine deoxycholate agar，XLD)，青島海博生物技術有限公司；氯化鈉，國藥集團上海化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、乙醇，德國Merck公司。

本試驗所用腸炎沙門氏菌(S.Entertidis NCM 61，Accession：PRJNA492709)分離自冰鮮雞肉屠宰分割臺接觸面，sRNA SaaS缺失突變株由λ-Red 同源重組技術構建得到[3]。

1.2 儀器與設備

BIO Ⅱ Advance 4生物安全柜，美國BAKER公司；SQL 1010C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限醫療設備廠；QTRAP 6500+質譜儀，美國AB SCIEX公司；UPLC 30A色譜儀，日本SHIMADZU公司；5427 R臺式高速冷凍離心機離心機，德國艾本德Eppendorf股份公司；easySpiral Pro全自動螺旋接種儀，法國Interscience有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液準備 取凍存于-80℃的腸炎沙門氏菌野生株和突變株，室溫溶解后，在XLD平板上劃線，于37℃培養24 h。挑取單菌落于TSB培養基，于37℃培養24 h后，吸取菌懸液并接種至新鮮的TSB培養基，于37℃培養18 h，制成初始濃度為109CFU·mL-1的菌懸液，作為工作菌液。

1.3.2 粘附響應規律 將標準尺寸(75 mm×25 mm×1 mm)的不銹鋼、玻璃、聚丙烯3種材質的接觸表面薄片(以下簡稱“薄片”)均勻地插入塑料支架，使薄片直立地分布于可密封玻璃容器中，高壓滅菌(121℃、15 min)后備用。使用TSB培養基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，隨后注入上述玻璃容器中，菌懸液的用量能夠使薄片一半浸沒于液體，一半暴露于空氣中。密封后，于15、20、37℃分別培養24、48、72、96、120 h，培養過程中避免液面晃動。培養至規定時間后，使用0.85%生理鹽水洗去薄片表面的浮游菌體，控干液體后將薄片投入裝有40 mL 生理鹽水的均質袋中，使用拍擊式均質器以每分鐘360下的速度連續拍擊1 min。接著使用生理鹽水對均質液進行10倍梯度稀釋，并選取2～3個稀釋度，用全自動螺旋接種儀吸取100 μL稀釋液并均勻地涂布至TSA平板，于37℃培養20 h后計數。每組試驗重復4次。

1.3.3 胞外代謝組學分析

1.3.3.1 胞外多聚物的采集 使用TSB培養基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，并接種于48孔細胞板，每塊孔板接入同一株菌，每孔接入800 μL稀釋液。同時，接種無菌TSB作為陰性對照。將細胞板置于37℃培養48 h。輕輕倒出48孔板中的培養基，用0.85%生理鹽水清洗3次后吸除每孔中殘留的液體。向任意一孔加入200 μL生理鹽水，使用無菌棉簽蘸取液體后，依次對每一孔壁進行擦拭，將擦得的粘附體收集到2 mL無菌離心管中。再次向任意一孔加入400 μL生理鹽水，用移液槍反復吹打收集殘留的菌膜，隨后將液體轉移至下一微孔，重復上述操作，直至每孔中的菌膜被完全收集，將孔板和棉簽上的菌液全部轉移至上述2 mL離心管。離心(5 000×g，10 min，4℃)后，上清液即為胞外多聚物溶液(extracellular polymeric substances，EPS)[14]。每組試驗重復6次。

1.3.3.2 液相色譜-質譜聯用分析 取50 μL的EPS，向其中加入150 μL預冷的純甲醇提取劑，渦旋1 min后，放入液氮中速凍3 min，取出，冰上解凍3 min，渦旋2 min，循環3次。離心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)后，取上清液用于液相色譜-串聯質譜聯用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS-MS)分析。

液相條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm ×100 mm； 流動相：A相為超純水(0.04%乙酸)，B相為乙腈(0.04%乙酸)；洗脫梯度: 0 min 水/乙腈(95∶5，v/v)，11.0 min 為 5∶95 v/v，12.0 min為 5∶ 95 v/v，12.1 min 為 95∶5 v/v，14.0 min 為 95∶5 v/v；流速 0.4 mL·min-1；柱溫 40℃；進樣量 2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)溫度500℃，質譜電壓 5 500 V(positive)，-4 500 V(negative)，離子源氣體Ⅰ(ion source gas Ⅰ, GS Ⅰ)55 psi，氣體Ⅱ(Gas Ⅱ, GS Ⅱ)60 psi，氣簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導電離(collision-activated dissociation, CAD)參數設置為高。在三重四極桿中，每個離子對根據優化的去簇電壓(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)進行掃描檢測。

1.3.3.3 代謝物定性和定量 基于靶向標品數據庫(metware database，MWDB)對信息進行定性分析。代謝物定量利用三重四極桿質譜的多反應監測模式(MRM)分析完成。差異代謝物的篩選標準為：變異系數(fold change，FC)≥ 2 和 FC ≤ 0.5；變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)≥ 1。

1.3.4 數據處理 使用SPSS 23.0對數據進行統計分析，采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Prism 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 粘附響應規律

由圖1可知，在本研究中，3種材質的接觸表面在37℃下沙門氏菌菌體粘附數量最高，20℃次之，而15℃最低。由曲線的走勢可以發現，腸炎沙門氏菌的粘附數量隨著時間的推移總體呈現出先增長后趨于平穩并有緩慢下降的趨勢，這與生物菌膜形成過程中所經歷的粘附、成熟、瓦解等關鍵階段吻合，生物菌膜生長規律在其中有所體現。值得關注的是，在37℃下，ΔSaaS的菌膜形成能力顯著大于WT，該現象在3種接觸面上均有發生，并在聚丙烯表面尤為明顯；而在20和15℃下，除聚丙烯表面外并未發現類似現象。

注：A：不銹鋼表面；B：玻璃表面；C：聚丙烯表面。內嵌圖為37℃下粘附曲線的局部放大圖。 **代表WT與ΔSaaS在0.01水平有顯著性差異。Note：A: Stainless steel surface. B: Glass surface. C: Polypropylene surface. The inline images are a zoom of the adhesion curve at 37℃. ** indicates significant differences at 0.01 level between WT and ΔSaaS.圖1 粘附響應規律Fig.1 Adhesion law in response to environmental conditions

2.2 胞外代謝組學

2.2.1 代謝物定量結果 腸炎沙門氏菌生物菌膜胞外代謝物的定量結果如表1所示。本研究檢測到ΔSaaS和WT的代謝物總數為275；差異代謝物總數為54，其中53個顯著上調。

2.2.2 主要差異代謝物 本研究根據差異倍數大小，對檢測到的差異代謝物進行了排名，并將排名前20的代謝物展示如下(圖2)。在顯著上調的差異代謝物中，琥珀酸和氨基丙二酸的差異倍數最大；二乙醇胺為唯一顯著下調的差異代謝物。

2.2.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

2.2.3.1 差異代謝物KEGG分類 本研究對差異顯著代謝物的KEGG注釋結果按照通路類型進行了分類，分類結果如圖3所示，縱坐標為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標為注釋到該通路的代謝物個數及其個數占被注釋的代謝物總數的比例。本試驗差異代謝物的注釋結果主要集中于代謝途徑(92.5%)、ABC轉運蛋白(35%)、二級代謝物的生物合成(25%)、不同環境中的微生物代謝(20%)、嘧啶代謝(18%)、嘌呤代謝(15%)、氨基酸的生物合成(15%)和精氨酸和脯氨酸代謝(15%)等通路。

表1 差異代謝物數量統計Table 1 Statistics of differential metabolites

圖2 差異代謝物條形圖Fig.2 Bar graph of differential metabolites

2.2.3.2 差異代謝物KEGG富集 本研究對差異代謝物進行了KEGG通路富集(圖4)。本研究中的差異代謝物較為顯著地富集于代謝途徑、ABC轉運蛋白、嘧啶代謝、嘌呤代謝等通路。

3 討論

接觸表面材質可能因為粗糙度、表面疏水性等特性的不同而影響生物菌膜的形成[15-17]。本研究以304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料作為載體，并于不同環境溫度下對生物菌膜進行培養，其中37℃為沙門氏菌生長的最適溫度，20℃貼近大部分肉類加工車間的環境溫度，15℃用于模擬低溫。本研究發現，腸炎沙門氏菌在不同材質接觸表面的粘附量并無明顯差異。而De Oliveira等[18]研究禽肉源沙門氏菌時發現，菌膜在玻璃、聚氯乙烯和不銹鋼上的長勢不同，且玻璃最不利于其形成。該結果與本研究結果不一致，可能是由于菌株的來源或種類不同。值得注意的是，在37℃下，ΔSaaS與WT的粘附差異在初始粘附和微菌落形成階段(24 h)相對較小，在菌膜成熟階段(72和96 h)明顯擴大。說明sRNA SaaS能夠在37℃下抑制生物菌膜的形成，且這種調控作用可能最早發生于粘附期，并在成熟期得到強化。基于以上發現，本研究進一步對37℃下野生株與突變株生物菌膜的胞外代謝物進行了分析。

圖3 差異代謝物KEGG分類圖Fig.3 KEGGClassification of differential metabolites

圖4 差異代謝物KEGG pathway富集結果Fig.4 Enrichment of KEGG pathways of differential metabolites

差異代謝物大量富集于ABC轉運蛋白途徑，ABC轉運蛋白屬于膜結合蛋白，對生物菌膜的形成起到重要作用[19-20]。Vanderlinde等[20]發現，ABC轉運蛋白的缺失會造成胞外多糖分泌減少，并使生物菌膜的形成受到嚴重損害。在本研究中，該途經下的無機與有機離子轉運系統中的亞精胺、腐胺、甘氨酸甜菜堿等代謝物在突變株組發生了上調。sRNASaaS的缺失可能通過促進亞精胺/腐胺結合周質蛋白(spermidine/putrescine-binding periplasmic protein, PotD) 的合成，從而改變多胺的合成速率，并刺激生物菌膜的形成[21]；與此同時，甘氨酸甜菜堿也具有恢復和促進生物菌膜形成的作用[22-23]。

嘌呤/嘧啶代謝途徑也富集了大量差異代謝物，腺嘌呤、尿嘧啶、肌苷等代謝物在突變株組發生上調。研究表明，核苷酸生物合成途徑與卷曲菌毛和纖維素的產生緊密相關，且嘧啶核苷酸的可用性能夠強烈影響卷曲蛋白操縱子的轉錄[24]。卷曲菌毛和纖維素是生物菌膜胞外多聚物的重要組分。前者與細菌在非生物表面的粘附和菌膜形成相關[25]，后者有助于成熟菌膜三維結構的形成并對菌體細胞起保護作用[26]。而嘌呤生物合成途徑能刺激多糖的合成，外源尿嘧啶能觸發纖維素的合成，外源添加肌苷能使生物菌膜的形成量顯著增加[27-28]。sRNA SaaS的缺失可能通過刺激核苷酸的合成，加強EPS的分泌，從而促進細胞間的粘附和生物菌膜的成熟。另一方面，嘌呤/嘧啶代謝涉及ATP、DNA與RNA的合成。胞外DNA(eDNA)作為胞外多聚物，起到維持菌膜三維立體結構、為細胞提供底物和增強遺傳物質交流的作用[29]。sRNA SaaS的缺失也可能通過促進核甘酸的合成代謝，增加eDNA的合成與分泌，進而促進成熟菌膜的形成。

氨基酸代謝途徑也有較多差異代謝物富集，且N-乙酰天冬氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸等氨基酸在突變組發生上調。Rajendran等[30]在針對白色念珠菌(Candidaalbicans)的研究中也觀察到類似現象，發現氨基酸代謝在生物菌膜形成能力較強的分離株組中上調。氨基酸代謝是細菌正常生長的重要條件，在生物菌膜形成早期，氨基酸水平的增加有助于菌膜成熟階段細菌生物量的增加[31]。此外，與能量代謝相關的琥珀酸[32]在本試驗突變組也發生大幅上調，為變化最顯著的代謝物。這說明sRNA SaaS缺失突變株可能具有更強的碳代謝率，能夠更快地進行增殖，進而能夠在生物量的維度上更快地形成生物菌膜。

綜上，sRNA SaaS可能通過抑制氨基酸代謝和碳代謝減緩細菌的增殖，同時通過抑制嘌呤/嘧啶代謝，減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，分別從菌體細胞的數量和胞外多聚物的產量兩方面抑制腸炎沙門氏菌生物菌膜的形成，并阻礙菌膜三維立體結構的維持(圖5)。

圖5 sRNA SaaS對生物菌膜形成的作用機制Fig.5 Mechanism of sRNA SaaS on biofilm formation

4 結論

本研究發現sRNA SaaS對腸炎沙門氏菌粘附能力的影響具有溫度依賴性。在37℃下，SaaS 能夠抑制該菌在304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料表面形成生物菌膜，且抑制作用在聚丙烯表面尤為明顯。進一步分析發現，sRNA SaaS可能一方面通過減緩細菌的增殖，另一方面通過減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，實現對生物菌膜形成的抑制作用。本研究成果有助于完善生物菌膜的理論體系，為揭示sRNA SaaS對生物菌膜形成的分子作用機制提供線索，為研發生物菌膜新型控制技術提供新思路。