大蔥伴生甜瓜栽培對根際土壤酶活性和細菌群落的影響

倪 棟 陳應素 李 爽 湯雨凡 劉翔毓 殷 樂 周艷麗,*

(1 吉林農業大學園藝學院，吉林 長春 130118；2 吉林農業大學教研基地管理處，吉林 長春 130118； 3 吉林農業大學資源與環境學院，吉林 長春 130118；4 吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118)

甜瓜(CucumismelonL.)是一種高營養價值、高經濟價值的作物，近年來成為吉林省夏季日光溫室和塑料大棚主栽經濟作物之一，然而栽培地未經科學規劃、過度利用以及濫用農藥、肥料等[1]，導致甜瓜根際土壤的微生態環境惡化，嚴重影響了甜瓜的生長發育，使甜瓜品質下降并且大幅減產。因此，當務之急是解決甜瓜生產困境。目前，基于綠色、可持續發展的理念，在生產上常利用化感作用進行不同植物間栽培，以期達到綠色有機生產的目的。伴生栽培是在園藝生產中常見的一種以收獲主栽作物為目的的特殊間作模式。

伴生栽培是將2種或2種以上生長季節相近或相似的作物按一定比例分行或分帶種植在同一田地上的一種精耕細作、集約化種植的傳統技術[2-3]。夏秀波等[4]研究證明大蔥伴生能夠促進番茄植株生長，延緩葉片衰老；有研究證明分蘗洋蔥伴生能夠提高番茄根際土壤微生物的多樣性，并且能夠增強植株的抗病能力[5-6]。蔥蒜類蔬菜因具有獨特的抑菌特性和田間土壤生態環境改良效應，現已受到越來越多的重視，目前對蔥蒜類蔬菜的開發和利用也逐漸走向多元化。通過近年針對大蒜(AlliumsativumL.)[7-8]、分蘗洋蔥(AlliumcepaL.)[9-10]和大蔥(AlliumfistulosumL.)[4]緩解土壤連作障礙的研究發現，主栽作物分別與這3種作物輪作、間作、套作、伴生、填閑等栽培方式，不僅可以增加地上部的物種多樣性[11]，而且可以通過根系分泌物對土壤微生態環境起到調控作用，進而抑制病原微生物的生長[12]，促進幼苗植株生長。

土壤微生態環境的變化情況直觀反映了伴生栽培的作用。微生物能對土壤中的生物殘體[13]及有機物進行轉化、水解，同時對土壤養分的增加有促進作用，是土壤中最活躍的部分之一[14]。研究表明微生物群落結構的組成是反映土壤中物質代謝旺盛程度的重要指標之一[15]。細菌是構成土壤微生物的主要生物量之一，占整個土壤微生物群落的70%～90%，并且在維護土壤健康、拮抗土傳病害等方面做出了積極貢獻[16]。細菌在土壤中發揮的重要作用直接體現在土壤的肥力狀況上[17]，并最終影響植物的生長[18]。土壤微生物數量和群落結構[19]等方面的初期研究大多采用的較早的生物技術，如變性梯度凝膠電泳(pcr-denaturinGGradienTGel electrophoresis，PCR-DGGE)技術[19]、Biology技術[20]，僅能檢測土壤微生物的優勢菌落，而無法檢出組成占比低的微生物。隨著現代高通量測序技術的推廣及應用，土壤微生物中的優勢物種、稀有物種及部分未知物種都可以被檢測出來[21]。為此，本試驗基于土壤農化性質測定、土壤酶測定、高通量測序方法，分析大蔥伴生栽培對甜瓜根際土壤中細菌群落結構階段變化的影響，綜合評價根際土壤農化、酶活性與土壤細菌群落結構的互作效應，并通過后期對甜瓜果實進行測產來驗證伴生栽培的效果，以期為建立適合甜瓜持續適效的栽培模式提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

供試材料薄皮甜瓜品種為景路甜蜜王，大蔥品種為普威長夏，均購自吉林省長春市種子市場。試驗于2020年6月至12月在吉林農業大學園藝學院蔬菜生產基地(125°27′E，43°46′N)進行，栽培土壤類型是黑壤土，其養分性狀：pH值7.02，有機質58.35 g·kg-1，堿解氮99.47 mg·kg-1，速效磷201.24 mg·kg-1， 速效鉀701.25 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗設4個處理，分別記作DZ1、BS1、DZ3、BS3，詳見表1。于2020年6月18日，將溫室原土和商品雞糞按9∶1的比例攪拌均勻裝盆，然后將5株株高20 cm的蔥沿著26 cm×21 cm營養缽的邊緣均勻地移栽到盆中。6月20日直播甜瓜種子于營養缽的中心位置，每盆3粒。營養缽按照45 cm×90 cm的株行距半埋在溫室內。在甜瓜兩葉一心時進行間苗，選留一株健壯秧苗，5～6片真葉時去掉主蔓生長點，選留兩條長勢一致的子蔓，抹掉孫蔓側芽，吊蔓栽培，分別在第7和第15節留瓜，每條子蔓留兩瓜，每株四瓜，待子蔓生長至20片葉時摘心，常規田間管理。栽培期間追肥一次，在果膨大期隨水施入磷鉀復合肥，施入量為每盆12 g。本試驗每個處理設置30盆，4個處理共120盆。

表1 試驗處理Table 1 TesTTreatment

1.3 測定項目與方法

1.3.1 產量及果實品質測定 在2020年9月18日(播種90 d后)采收甜瓜果實。甜瓜果實硬度采用FT-327水果硬度計(北京金科利達電子科技有限公司)測定；可溶性固形物采用MHY-22747手持式糖量計(北京美華儀科技有限公司)測定；根據平均單果重、單株結瓜數和栽培密度統計單株產量和畝產。

1.3.2 土壤性質測定 分別于2020年7月30日(播種40 d后)和2020年9月8日(播種80 d后)采用抖根法[22]采集土樣，每個處理隨機選取5盆，取土壤表層下15 cm的土樣，約200 g。樣品采集后仔細去除新鮮土樣中可見的植物殘體及其他雜質，將其中部分土放入無菌離心管中，置于液氮內速凍，然后置于-80℃ 超低溫冰箱中保存，用于土壤細菌群落結構分析；另一部分土壤樣品經自然風干后過100目篩，用作測定土壤農化理化及土壤酶活性。

土壤農化性質測定參照《土壤農化分析》[23]。土壤pH值采用F-74酸度計(日本HORIBA)測定；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀消煮容量法測定；土壤堿解氮含量采用堿解擴散法測定；土壤速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀含量采用火焰光度法測定。

土壤酶活性測定參照《土壤酶及其研究法》[24]。土壤脲酶活性采用靛酚藍比色法測定；土壤酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定；土壤過氧化氫酶活性采用比色法測定。土壤漆酶活性采用活性光度法測定[25]。

土壤細菌群落檢測土樣送于諾禾生物科技有限公司并基于高通量測序技術完成細菌群落結構分析。利用諾禾生物科技公司提供的Novomagic云數據分析平臺進行根際土壤細菌多樣性分析，構建物種組成群落圖。

1.4 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2016軟件進行處理，數據的多重比較使用DPS數據處理系統。

2 結果與分析

2.1 伴生對甜瓜果實產量及品質的影響

伴生對甜瓜果實品質和產量的影響見表2。伴生處理與單作處理的甜瓜果實可溶性固形物含量、果實硬度均無顯著差異；伴生處理的單果重、單株產量以及畝產均顯著高于單作處理，伴生處理單果重和畝產分別較單作增加13.1%和12.7%。整體來看，伴生栽培可以促進甜瓜生長，進而增加單果重及產量。

表2 伴生對甜瓜果實品質和產量的影響Table 2 Effects of companion on fruit quality and yield of muskmelon

2.2 伴生對根際土壤農化性質及土壤酶活性的影響

由表3可知，播種40 d后，伴生處理土壤的pH值、有機質含量、堿解氮含量、速效鉀含量均低于單作處理，速效磷含量高于單作處理；另外，伴生處理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、漆酶活性均高于單作處理，其中脲酶和漆酶活性差異達顯著水平。播種80 d后，伴生處理的土壤pH值、有機質、速效磷含量高于單作處理，其中速效磷含量顯著高于單作處理，而堿解氮、速效鉀含量則顯著低于單作處理；此外，伴生處理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、漆酶活性均顯著高于單作處理。

表3 不同處理的土壤農化性質和土壤酶活性Table 3 Soil agrochemical properties and soil enzyme activities of the soil treated with different ways

2.3 伴生對根際土壤細菌群落結構的影響

2.3.1 根際土壤細菌多樣性分析 伴生對根際土壤細菌多樣性的影響見表4。隨著栽培時間的延長，伴生處理土壤細菌的Ace指數、Chao1指數、Shannon指數整體呈降低趨勢。播種80 d后伴生處理的Shannon指數顯著小于播種40 d后的單作和伴生處理，表明大蔥伴生顯著減少了根際土壤細菌的數量，另外播種80 d后伴生處理的Simpson指數在所有處理中最低，表明伴生后期土壤細菌多樣性增加。本次測序各樣本文庫的覆蓋率均達98%以上，結果可以代表樣本中微生物的真實情況。

表4 伴生處理根際土壤細菌的多樣性指數分析Table 4 Analysis of microbial diversity index in the soil samples with differenTCoverinGTreatments

花瓣圖主要用于統計多個樣本中所共有和獨有的可操作性分類單元(operational taxonanic units，OTU)數量。由圖1可知，播種40 d后伴生處理和單作處理根際土壤中特有的細菌OUT數量是593、656，總OUT數量是3 724、3 787；播種80 d后伴生處理、單作處理特有的細菌OUT數量是432、454，總OUT數量是3 563、3 585。 共有的細菌OUT數量為3 131。

圖1 細菌OTU分類水平花瓣圖Fig.1 Diagram of Venn on OTU level of bacteria in different seedlings

2.3.2 根際土壤細菌OTU水平的主成分分析 圖2是從測序結果中提取出主成分(最主要的元素和結構)，通過一系列特征值和特征向量排序進行的主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)。樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似。由圖2可知，第一主成分對樣品差異的貢獻率為36.63%，第二主成分對樣品差異的貢獻率為24.51%。每個樣品的群落結構相似度較高，樣品傾向于聚集在一起，播種80 d后伴生處理的土壤樣本與其他樣本菌落組成結構差異最大，且其細菌菌落組成結構差異最小。因此，播種80 d后伴生處理對土壤細菌群落組成有顯著正相關影響。

2.3.3 根際土壤細菌結構分析 圖3展示了4個根際土壤樣本中門水平細菌群落結構。結果表明，4個根際土壤樣本中共有的主要細菌門有12個，其中變形菌門(Proteobacteria)占比最高，分別是33.07%、34.25%、32.31%、35.73%，而且播種40和80 d后單作處理土壤樣本的變形菌門、未名菌門(unidentified_Bacteria)、酸桿菌門(Acidobacterio)相對豐度均大于10%，播種40和80 d后伴生處理土壤樣本中只有變形菌門和未名菌門的相對豐度大于10%。

圖2 細菌OTU水平下PCoA圖Fig.2 The PCoA map of bacterial OTU level

圖4展示了4個根際土壤樣本中屬水平細菌群落結構。結果表明，4個根際土壤樣本中共有的主要細菌屬有11個，包括鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、拉爾斯頓菌屬(Ralstonia)、RB41、MND1、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、桿菌屬(Bryobacter)、類固醇桿菌(Steroidobacter)、蓋埃拉菌屬(Gaiella)、黃桿菌屬(Flavisolibacter)、哈良草菌屬(Haliangium)，而且播種80 d后伴生處理的土壤樣本中鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)的占比達到11.90%，高于其他3個土壤樣本。

圖3 細菌門分類水平結構分布圖Fig.3 The bacterial structure distribution aTThe phylum level

圖4 細菌屬分類水平結構分布圖Fig.4 The bacterial structure distribution aTThe genus level

2.3.4 根際土壤細菌菌落與土壤農化性質、土壤酶活性的相關關系 由圖5可知，鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)與漆酶和脲酶活性呈顯著正相關，與速效鉀含量呈極顯著負相關；拉爾斯頓菌屬(Ralstonia)和速效鉀含量呈顯著正相關；RB41與漆酶、脲酶、蔗糖酶活性呈顯著負相關；芽孢桿菌屬(Bacillus)和速效鉀含量呈極顯著正相關；芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和速效鉀含量呈極顯著負相關、桿菌屬(Bryobacter)與pH值、速效鉀含量呈顯著正相關；類固醇桿菌(Steroidobacter)和速效鉀含量呈極顯著正相關；蓋埃拉菌屬(Gaiella)和速效鉀含量呈顯著正相關。

注：AK：速效鉀含量；AP：速效磷含量；AN：堿解氮含量；OM：有機質含量；L：漆酶活性；CAT：過氧化氫酶活性；ACP：酸性磷酸 酶活性；UE：脲酶活性；SC：蔗糖酶活性。Note: AK: Available K content. AP: Available P content. AN: Hydrolyzable N content. OM: Organic matter content. L: Laccase activity. CAT: Catalase activity. ACP: Acid phosphatase activity. UE: Urease activity. SC: Invertase activity.圖5 根際土壤細菌群落與環境因子相關性Fig.5 Correlation heat map of soil bacterial community and environmental factors

3 討論

與單作處理相比，伴生后根際土壤中有機質、堿解氮、速效鉀含量均呈降低趨勢，且隨著伴生時間的延長，降低程度變緩，降低的原因可能是伴生大蔥與甜瓜競爭養分，后期出現變緩趨勢可能是通過伴生促進了土壤中原有養分的釋放，使土壤中的養分達到平衡狀態，這與趙曉翠[3]在甘藍伴生黃瓜研究中的結論相似。另外，在本研究中，接種80 d后伴生處理土壤中脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和漆酶活性總體顯著高于單作，表明伴生栽培后顯著提高了土壤酶活性，原因可能是通過伴生栽培造成了微生物互作，繼而活化了根際微生物的生命活動，進而提高了土壤酶活性，改變了土壤的養分含量，這與孟亞利等[26]在棉麥共生研究中的結果大致相符。但關于根際土壤中各項理化指標和各類酶活性與植物體內的養分傳送和轉導、植物生理生化狀況的具體關聯還有待進一步研究。

土壤微生物群落結構多樣性在維持生態系統功能上有著重要作用[27]。本研究結果表明，大蔥伴生栽培后減少甜瓜根際土壤細菌數量，這與夏秀波等[28]在大蔥伴生黃瓜上的研究結果相似；另外伴生栽培后增加了土壤細菌多樣性，改變了甜瓜根際土壤細菌群落結構。在細菌門水平上，變形菌門占比最高，并且伴生處理變形菌門的相對豐度高于單作處理。Liu等[29]發現變形菌門與有機質含量呈顯著或極顯著正相關，這與本研究結果趨勢大致相符，伴生栽培后期由于變形菌門豐度增加促進了土壤有機質含量的少量增加。酸桿菌門具有嗜酸性，其豐度受pH值影響[30]，土壤pH值降低有利于其生長[31]，因此伴生栽培后酸桿菌門豐度增加。在細菌屬水平上，鞘脂單胞菌屬為4個根際土壤樣本的共同優勢菌群。鞘脂單胞菌屬是一類豐富的新型細菌資源，可用于芳香化合物的生物降解[32]，進一步研究表明該菌屬在農業中也有廣泛應用[33]，對有機磷、氨基甲酸酯、五氯苯酚和除蟲菊酯[34]等三類農藥具有較好的降解能力，同時對其他一些農藥的降解也有良好效果[35]。鞘脂單胞菌屬作為一種有益菌屬，在解決甜瓜栽培地農藥殘留方面起到了積極作用。另有研究發現旱地中有機磷微生物主要是芽孢桿菌屬[36]。本研究中伴生栽培后增加了芽孢桿菌屬豐度，從而使根際土壤中速效磷含量提高，這與林啟美等[37]研究結果相符。正是由于這些有益菌屬的豐度增加改良了土壤生態環境。

通過對甜瓜測產得出伴生栽培后甜瓜單果重比單作栽培增加13.10%，推算得出畝產增加12.70%。這與前人研究結果一致，徐蕾[38]發現大蔥套作白菜的白菜鮮重較單作增加了35.71%；夏秀波等[4]在大蔥伴生番茄栽培試驗中，大蔥伴生番茄處理較番茄單作增產8.30%；李培穎等[39]在小麥伴生栽培黃瓜中，伴生處理產量比單作提高了4.7%。伴生處理后，甜瓜產量增加可以佐證大蔥伴生栽培甜瓜模式是有效的、可供推廣的栽培模式。

4 結論

本研究以大蔥伴生栽培甜瓜后，對伴生栽培土壤的農化性質、土壤酶活性和高通量測序結果分析，得出伴生后土壤農化性質改變、土壤酶活性增加、土壤中有益菌豐度增加，進而增加甜瓜產量。接種80 d后大蔥伴生栽培土壤的pH值、有機質含量高于單作，速效磷含量顯著高于單作；脲酶、蔗糖酶、漆酶等土壤酶活性均顯著高于單作；在門水平上變形菌門(Proteobacteria)等有益細菌門相對豐度增加；在屬水平上鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等有益菌屬相對豐度增加；相關性分析表明，土壤細菌與土壤脲酶、土壤漆酶活性、pH值、速效鉀含量有顯著相關性。表明大蔥伴生栽培甜瓜模式為解決甜瓜根際土壤的微生態環境惡化導致的大幅減產問題提供了參考。