[芐基-14C]-毒氟磷在大豆中的殘留分布和代謝產物動態變化

聞樊婷 鄭若楠 邵思遙 駱沛文 張素芬 余志揚 程 曦 葉慶富

(浙江大學原子核農業科學研究所/農業農村部和浙江省核農學重點實驗室，浙江 杭州 310058)

植物病毒是一類在寄主活體細胞內進行核酸和蛋白質外殼復制的病原物，素有“植物癌癥”之稱。植物病毒病會降低糧食作物的產量和品質，嚴重危害我國乃至世界的糧食安全，造成極大的經濟損失[1-3]。毒氟磷(Dufulin，N-[2-(4-甲基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O，O-二乙基膦酸酯)是我國自主創制的新型植物抗病毒劑，具有高效、低毒和低殘留等特點[4]，在煙草[5]、黃瓜[6]、番茄[7]以及南方水稻[8]等作物的病害防治中應用廣泛，市場前景良好。

近年來，關于毒氟磷母體環境行為的研究已有較多報道[9-10]，樊玲娥[11]優化了提取凈化毒氟磷殘留的方法并對其水化學降解進行了研究，發現自然水體中毒氟磷的水解半衰期為12.58～21.19 d。Wang等[12]采用高效液相色譜法研究了毒氟磷母體在土壤中的生物和非生物降解，發現水分和溫度的升高能加速毒氟磷母體在土壤中的降解，土壤中的微生物和酶能加快毒氟磷母體的降解，毒氟磷在Eutric Gleysols中降解最快，半衰期為17.59 d。前人采用超高液相色譜法分別研究了毒氟磷母體在水稻[13]、番茄[14]和西瓜[15]中的殘留消解規律，由半衰期看出毒氟磷母體在作物-土壤體系中降解較快。上述研究均表明毒氟磷在環境中容易發生降解，且以母體及其代謝產物的形式存在。然而目前國內外對毒氟磷在植物體內代謝的相關研究尚為鮮見。且有研究表明，農藥在降解過程中生成的代謝產物的毒性可能高于母體，如劉莉[16]發現低毒高效的有機磷殺蟲劑乙酰甲胺磷在蔬菜中易代謝為甲胺磷，其毒性比母體高30多倍。因此，研究毒氟磷在植物中的代謝規律對其安全性評價及殘留定義具有重要的現實意義。

本試驗選擇油料類作物大豆(Glycinemax)作為試驗對象，以[芐基-14C]-毒氟磷為示蹤劑，借助放射性追蹤溯源和精準痕量的特征，有針對性地取舍放射性目標代謝產物和非放射性雜質，消除復雜體系帶來的不良影響，快速確定農藥的代謝組分[17]。通過模擬田間噴霧施藥的方式研究14C-毒氟磷在大豆中的殘留分布特征和代謝動態規律，以期為客觀評價毒氟磷的安全性提供數據支持，并為毒氟磷的科學合理使用提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試標記化合物 [芐基-14C]-毒氟磷：浙江大學與上海啟甄環境科技有限公司合作制備，方法參考[18-19]，放射化學純度大于97%，化學純度大于98%，比活度為1.804×106Bq·mg-1(19.919 mCi·mmol-1)，結構式如圖1所示。

注：“*”表示14C 標記位置。Note: ‘*’ represents the position of 14C labeling.圖1 [芐基-14C]-毒氟磷結構式Fig.1 Structure of [benzyl-14C]-Dufulin

1.1.2 供試大豆 供試大豆品種為天隆一號，由浙江大學農業與生物技術學院唐桂香教授課題組提供。試驗栽培用土取自浙江省杭州市浙江大學紫金港校區農業試驗田內，泥炭購自德國維特集團公司，土壤和泥炭混合比為1∶1。

1.2 試驗設計

1.2.1 毒氟磷混合液的配制 按照毒氟磷田間推薦使用劑量300～500 g a.i.·hm-2，濃度為0.3 g·kg-1，并結合引入放射性活度需求，本試驗的施藥濃度為推薦施藥濃度的三分之二，即200.0 mg a.i.·L-1。準確量取245 mL超純水、2.5 mL乙二醇乙醚、2.5 mL吐溫80加入試劑瓶中，超聲混合5 min，得到1%的溶媒水溶液。稱取20.0±0.1 mg[芐基-14C]-毒氟磷、46.7±0.1 mg由硅藻土、木質素磺酸鈉和LS洗凈劑組成的空白粉劑(m∶m∶m=12∶1∶1)，用5 mL甲醇溶解，再用1%溶媒水溶液定容至100 mL，配成濃度為200.0 mg·L-1的毒氟磷混合溶液。

1.2.2 大豆的栽培與藥液噴施 將發芽的大豆種子播于裝有4.5 kg土壤的塑料盆中(直徑30 cm×高35 cm)，每盆播種5～6粒，共36盆。試驗模擬田間條件培養，在開花期施藥，用2 mL-K專用連續噴霧注射器(江西正略公司)均勻噴灑毒氟磷混合液，每盆植株約2.7 mL。待液滴自然風干后進行首次采樣(施藥后2 h)，隨后于第2、第5、第10、第15和第20天各采樣一次，每個采樣點設置6個重復。將大豆植株分為根、莖、葉、豆莢和豆子五部分，其中根部用去離子水洗凈。上述樣品分別用液氮冷凍粉碎，置于-18℃保存備用。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 放射性殘留量測定 稱取葉、莖和豆莢各200 mg，根和豆子各300 mg置于燃燒舟中，待HTC-501生物氧化燃燒儀(太倉華利達公司)燃燒室溫度達到900℃，催化室溫度達到680℃時，燃燒4 min，用10 mL閃爍液B收集放射性物質氧化燃燒后產生的14C-CO2，采用Tricarb-4910TR型液體閃爍計數器(美國PerkinElmer公司)測量其放射性活度并計算毒氟磷殘留在各部位中的含量，每組樣品設置3個平行，殘留濃度以毒氟磷母體計，計算公式為：

(1)

式中，C為14C-毒氟磷殘留濃度，mg·kg-1；Ai為鮮樣中的放射性活度，Bq；η為燃燒回收率；a為標記毒氟磷的放射性比活度，Bq·mg-1；m為樣品質量，kg。

1.3.2 毒氟磷母體及其代謝產物的提取純化 分別取各采樣點豆葉樣品約1.00±0.01 g于100 mL離心管中，依次采用30 mL乙腈和30 mL乙腈-水混合液(v:v=2∶1)進行提取，提取方法為：首先進行1 min渦旋震蕩，而后進行超聲提取20 min和搖床震蕩30 min；提取后樣品于-4℃、10 000 r·min-1條件下離心20 min，收集上清液。上述提取步驟分別重復2次。上清液經PES-0.45 μm針筒式濾膜過濾后，于35℃旋轉蒸發至全干，用5 mL甲醇溶液復溶。濃縮提取液用ProElut Carb/PSA小柱(500 mg/6 mL，Dikma)萃取除雜，流出液經氮吹定容至1 mL，轉至樣品瓶中供液相色譜分析。

取25.00±0.01 g噴藥后第20天的豆子樣品于100 mL離心管中；濃縮提取液用ProElut Carb小柱(500 mg/6 mL，Dikma)萃取除雜，其余處理步驟同豆葉。

注：M1：N-[2-(4-羥基甲基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯；M2：N-[2-(4-甲基-6-羥基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯；M3：N-[2-(4-甲基-6-葡萄糖基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯；M4：N-[2-(4-甲基-6-葡萄糖丙二酸酯基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯。Note: M1: [(2-Fluoro-phenyl)-(4-methanol-benzothiazol-2-ylamino)-methyl]-phosphonic acid diethyl ester.M2: [(2-Fluoro-phenyl)-(4-methyl-6-hydroxy-benzothiazol-2-ylamino)-methyl]-phosphonic acid diethyl ester.M3: [(2-Fluoro-phenyl)-(4-methyl-6-glucosyl-benzothiazol-2-ylamino)-methyl]-phosphonic acid diethyl ester.M4: [(2-Fluoro-phenyl)-(4-methyl-6-malonylglucoside-benzothiazol-2-ylamino)-methyl]-phosphonic acid diethyl ester.圖2 毒氟磷各代謝產物結構式Fig.2 Structure of Dufulin metabolites

1.3.3 豆葉及豆子中毒氟磷母體及其代謝產物的定量分析 將純化后的豆葉和豆子樣品，利用Alliance 2695E高效液相色譜(美國WATERS公司)和Tricarb-4910TR型液體閃爍計數器(美國PerkinElmer公司)聯用進行分離和放射性定量。進樣體積10 μL，柱溫30℃，二極管陣列檢測器檢測。用流動相A(水+0.1%甲酸，色譜純)和流動相B(乙腈+0.1%甲酸，色譜純)以0.8 mL·min-1的流速洗脫，洗脫梯度時間分別為0、8、12、20、23和37 min時，流動相B體積分數分別為10%、30%、35%、35%、55%和100%。分別收集具放射性的洗脫液，保留時間為33.5～34.5 min(毒氟磷母體)、18.3～19.8 min(M3)、20.8～22.0 min(M4)、27.2～27.6 min(M1)和28.1～28.9 min(M2)，每個收集瓶中加入10 mL閃爍液A，用液體閃爍計數器測量其放射性活度。根據比活度、分子量、樣品的放射性活度和質量，計算毒氟磷母體及其各代謝產物的殘留濃度。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0、Origin 9.0對試驗數據進行統計處理與分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗差異的顯著性(P<0.05)。數據均以平均值±標準差表示。

根據公式計算毒氟磷母體在豆葉中的半衰期[20]：

Ct=C0×e-kt

(2)

DT50=ln2/k

(3)

式中，Ct為t時刻毒氟磷母體的殘留濃度，mg·kg-1； C0為毒氟磷母體在首次取樣的殘留濃度，mg·kg-1；k為降解速率常數，t為施藥后時間，d；DT50為毒氟磷母體在豆葉中的半衰期，d。

2 結果與分析

2.1 [芐基-14C]-毒氟磷在大豆不可食部位中的殘留分布規律

大豆葉、莖、根、豆莢中的14C-毒氟磷殘留分布及動態變化如圖3所示。施藥初期到收獲期，葉中放射性殘留量占整株總放射性比值為84.647%～89.889%，莖中為6.366%～9.702%，豆莢中為1.675%～5.546%，根中為0.081%～0.291%。這表明14C-毒氟磷主要殘留在葉片上，轉入其他部位的量較少；施藥后整個試驗過程，殘留分配比均呈現葉>莖>豆莢>根的規律。

圖3 [芐基-14C]-毒氟磷在大豆葉、莖、豆莢、根中的的殘留分布Fig.3 The residual distribution of [benzly-14C]-Dufulin in leaves, stems, shells and roots of soybeans

大豆各部位中[芐基-14C]-毒氟磷(母體及其代謝產物)總殘留濃度隨時間變化如表1所示，在大豆植株各部位中14C-毒氟磷的總殘留濃度均呈現為：葉>莖>豆莢>根。與施藥初期相比，收獲期葉和莖中殘留濃度均顯著下降，而根中的殘留濃度則顯著上升，豆莢的殘留濃度無顯著變化。

表1 不同取樣時間點下大豆各部位中[芐基-14C]-毒氟磷的殘留濃度Table 1 The residual concentration of [benzyl-14C]-Dufulin in soybeans’ parts at different time points /(mg·kg-1)

2.2 大豆葉中[芐基-14C]-毒氟磷主要代謝產物的動態變化

大豆葉中[芐基-14C]-毒氟磷母體及其代謝產物占可提取殘留比例及殘留濃度的動態變化規律如圖4和表2所示。結果表明，隨著施藥后培養時間的推移母體占可提取殘留比例及其殘留濃度均逐漸降低，而(M1+M2)、M3、M4占可提取殘留比例及對應的殘留濃度則呈遞增趨勢。

表2 不同取樣時間點下大豆葉中毒氟磷母體及其代謝產物的殘留濃度Table 2 The residual concentration of Dufulin parent and metabolites in leaves at different time points /(mg·kg-1)

圖4 大豆葉中毒氟磷母體及其四種代謝產物相對含量動態變化Fig.4 The dynamics of Dufulin parent and metabolites in leaves of soybeans

在施藥初期，葉中放射性殘留物組成為毒氟磷母體、M1和M2，其中母體相對含量占可提取殘留比例為97.990%，殘留濃度為21.675 mg·kg-1；(M1+M2)相對含量之和占可提取殘留比例僅為0.648%，殘留濃度為0.149 mg·kg-1。收獲時，葉中放射性殘留物組成發生變化，新增了M3和M4這2個產物。其中M4占比為20.526%，殘留濃度為3.838 mg·kg-1；M3占比為11.333%，殘留濃度為2.431 mg·kg-1；(M1+M2)占比為10.822%，殘留濃度為1.464 mg·kg-1；此時母體占比下降至53.443%，殘留濃度僅為6.960 mg·kg-1。總體上看，施藥后整個培養時期，葉中殘留物含量以母體最高，M4次之，M3和(M1+M2)相近且二者間無顯著差異(P>0.05)。收獲期時，葉中殘留物濃度呈現為：母體>M4>M3>(M1+M2)。

2.3 [芐基-14C]-毒氟磷母體及其代謝產物在可食豆子中的殘留

豆子中的[芐基-14C]-毒氟磷殘留物含量占比及殘留濃度動態變化如表3所示，在施藥后初期豆子中的毒氟磷殘留物含量僅占0.003%，隨著時間的推移，豆子中14C-毒氟磷殘留物含量占比逐漸增加，至收獲時達到最大值，占比為0.211%，此時殘留濃度(按母體折算)為0.059 mg·kg-1。

表3 豆子中14C殘留占植株總放射性殘留含量占比及殘留濃度變化Table 3 The content proportion and residual concentration of [benzyl-14C]-Dufulin in soybean beans

收獲期時豆子中[芐基-14C]-毒氟磷母體及其代謝產物占可提取殘留比例及殘留濃度見表4。結果表明，收獲時，豆中放射性殘留物組成主要為毒氟磷母體、M1、M2、M3和M4。其中母體含量最高，占比51.932%，殘留濃度為0.021 6 mg·kg-1；而M4占比為20.301%，殘留濃度為0.013 9 mg·kg-1；M3占比為15.979%，殘留濃度為0.009 5 mg·kg-1；(M1+M2)占比為11.788%，殘留濃度為0.005 1 mg·kg-1。

3 討論

3.1 [芐基-14C]-毒氟磷母體在豆葉中的降解與轉化

本試驗結果表明，毒氟磷母體在豆葉的降解過程符合一級動力學反應指數方程，根據不同時間點毒氟磷母體在豆葉中的殘留濃度得出動力學方程為Ct=16.578e-0.045t(R2為0.932 0)，半衰期為15.32 d。Zhang等[13]和Zhu等[14]研究表明，毒氟磷在不同地點、不同年份半衰期不一致，在水稻中降解半衰期范圍為7.7～11.3 d，在番茄降解半衰期范圍為2.8～9.0 d。本試驗得到毒氟磷在大豆中的半衰期比這些作物的半衰期長，可能是由作物種類、栽培條件、氣候因素(溫度及濕度、降水量)等復雜因素不同導致。本試驗采用模擬田間試驗的方式并結合放射性同位素示蹤技術，靈敏度高、檢測結果直觀準確，更具說服力和可信性。

在豆葉中，除毒氟磷母體外還有4種代謝產物，根據圖2代謝產物的結構信息和表2代謝產物的殘留濃度，初步推斷毒氟磷在豆葉中有2條代謝途徑(圖5)。其中代謝產物M1、M2的形成歸結為毒氟磷的Ⅰ相代謝，主要發生了氧化反應，毒氟磷母體噻唑基苯環甲基上的C-H鍵和噻唑苯環甲基間位C-H鍵可能分別在細胞色素P450s酶系作用下氧化形成羥基[21]。Ⅰ相代謝改變農藥母體結構，增加其極性，一般形成毒性更低的化合物；但某些特殊情況則可能形成毒性高于母體的物質。如除草劑甲草胺通過P450s酶系催化的羥基化反應以及其他酶系作用下形成的主要代謝產物二烷基醌亞胺，具有致癌作用[22-24]。因此，M1和M2的毒性可能高于母體，后續需進行毒理學試驗確證。代謝產物M3和M4的形成歸為毒氟磷的Ⅱ相代謝，主要是經Ⅰ相代謝產物的-OH基團與葡萄糖、丙二酸等內源物質發生軛合反應而形成[25-26]。M2可能先在UDP-O-糖基轉移酶(UDP-O-glycosyltransferases，UGTs)催化下與葡萄糖軛合形成產物M3，再通過丙二酰基轉移酶(malonyltransferases，MTs)進一步與丙二酸結合形成產物M4；M2也可能在UGTs催化下直接與丙二酸葡萄糖結合形成代謝產物M4。Ⅱ相代謝形成的軛合物水溶性通常比母體更強，毒性更低[27]。因此，一般情況下M3、M4的毒性低于母體。

圖5 毒氟磷在豆葉中可能的代謝途徑Fig.5 Potential metabolic pathways of Dufulin in soybean leaves

3.2 [芐基-14C]-毒氟磷在豆葉和豆子中的殘留定義

目前國內外均未對大豆中毒氟磷的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)值作出相關規定。對于未作出最大殘留限量規定的農藥，歐盟、日本和新西蘭等國家一般將最大殘留量定為0.01 mg·kg-1。本試驗結果表明，收獲期時，不可食豆葉中殘留物相對含量均大于可提態殘留的10%，且毒氟磷母體及其代謝產物M3、M4的殘留濃度均大于0.01 mg·kg-1； 在可食豆子中毒氟磷母體及其代謝產物M4的相對含量均大于可提態殘留的10%，且二者的殘留濃度均大于0.01 mg·kg-1。 因此，毒氟磷在不可食豆葉中的殘留主要為母體、M3(N-[2-(4-甲基-6-葡萄糖基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯)和M4(N-[2-(4-甲基-6-葡萄糖丙二酸酯基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O,O-二乙基甲基磷酸酯)；在可食豆子中的殘留主要為母體和M4。

根據我國《NY/T 3096-2017農作物中農藥代謝試驗準則》[28]、經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)[29]和美國環保局(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)[30]農藥代謝試驗導則，將相對含量超過10%和殘留濃度大于0.05 mg·kg-1的代謝產物納入毒氟磷在豆葉和豆子中的殘留定義。在豆葉中的殘留定義為毒氟磷母體、M3和M4；而豆子中母體及其代謝產物殘留濃度均小于0.025 mg·kg-1，因此不納入殘留定義。

4 結論

本研究采用模擬田間試驗的方式研究[芐基-14C]-毒氟磷在大豆中的殘留分布和代謝產物動態變化。在整個試驗過程中，毒氟磷在大豆中的轉運能力非常有限，大部分毒氟磷殘留物集中在葉上，只有整株總放射性的0.502%最終轉移到未施藥部位根和豆子中。毒氟磷在豆葉和收獲期豆子中存在4種相同的代謝產物，通過產物結構和相對含量信息，推斷了毒氟磷在豆葉和豆子中可能的代謝途徑，得出毒氟磷在可食豆子中的殘留主要為母體和M4。