蓮藕采后主要致腐真菌分離鑒定及生物學特性研究

賈 樂 劉瑞玲 房祥軍 陳杭君,* 郜海燕,*

(1 浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321000；2 浙江省農業科學院食品科學研究所/農業農村部果品產后處理重點實驗室/浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021)

蓮藕(NelumbonuciferaGaertn.)屬睡蓮科蓮屬植物，在我國種植歷史悠久，營養價值豐富，是國內外廣受歡迎的水生根莖類蔬菜[1]。蓮藕富含鉀、鐵、銅、維生素和膳食纖維等營養元素對維持心臟及健康、降低血壓、提高免疫力等有一定的功效[2-3]，具有抗肥胖、保肝、抗菌、利尿和清熱生津等藥用功能[4-6]，深受消費者喜愛，市場份額逐年增加[7]。蓮藕已成為人們日常生活飲食中重要的組成部分[8]。但由于蓮藕組織嬌嫩，含水量高，極易受微生物侵染，常溫下貯藏5～7 d便會出現褐變、干縮、霉爛等問題[9]，在很大程度上影響蓮藕的可食用品質，縮短蓮藕貨架期，造成資源浪費和經濟損失。

果蔬采后腐爛的原因主要有生理衰老、機械損傷和侵染性病害，其中大部分采后腐爛損失由病原菌侵染引起[10]，在病原微生物中，真菌對果蔬貯藏期間的危害最為嚴重且種類數量最多[11]。目前對蓮藕采后貯藏方面的報道主要集中在保鮮技術方面，在微生物病害方面的研究較少，且大部分研究是從田間直接采集病株進行致病微生物的分離鑒定。目前國內已報道的尖孢鐮刀菌引起的蓮藕腐敗病[12]、膠孢炭疽菌引起的蓮藕炭疽病[13]、睡蓮假尾孢菌引起的黑斑病[14]等均為真菌引起的蓮藕采前病害。也有報道對低溫貯藏條件下的腐敗蓮藕進行病原菌分離，羅海莉[15]對采后4～10℃貯藏的蓮藕腐爛病原菌進行分離發現，其主要病原菌為芽枝孢霉、交鏈孢霉和鐮刀菌；李慧[16]進一步研究確定低溫下引起蓮藕采后腐爛的主要致腐病原菌為茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。但針對蓮藕采后常溫貯藏過程中的致腐微生物相關研究較少。蓮藕采收于高溫季節，在常溫下極易被微生物侵染而發生腐敗，因此新鮮蓮藕采后在常溫條件下最多能貯藏7 d。本研究對25℃常溫貯藏條件下發生腐敗的蓮藕進行病原菌分離鑒定，并研究其主要致腐真菌的生物學特性，以期為后續采取針對性的防腐保鮮措施提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

以鄂蓮五號蓮藕為試驗材料，樣品采自浙江省杭州市余杭區灣里塘蓮藕合作社。于采摘當天運回實驗室，挑選50根大小均一、色澤亮白、無機械損傷和病蟲害的蓮藕，隨機分成10組，用紫外照射過的聚乙烯PE袋進行包裝，每袋約5 kg，模擬常溫下自然貯藏條件，將包裝好的蓮藕挽口放置于濕度40%～50%，溫度25℃的條件下貯藏，每天定期觀察其發病情況。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)、平板計數培養(plate count agar, PCA)、孟加拉紅培養基，上海盛思生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒，上海生物工程股份有限公司；葡萄糖、D-果糖、麥芽糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、尿素，上海生物工程科技有限公司；硫酸銨，上海凌峰化學試劑有限公司；酵母浸出粉，上海盛思生化科技有限公司；甘露醇，上海源葉生物科技有限公司；乳糖，上海伯奧生物科技有限公司；麥芽糖，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫療器械株式會社；MJX-160B-Z霉菌培養箱，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；BSC-130011A2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術科技有限公司；Peltier Thermal Cycler MG48 PCR儀，美國BioRad公司；Axio Vert A1蔡司倒置熒光顯微鏡，德國卡爾蔡司股份公司；WD9413C凝膠成像分析系統，北京六一生物科技有限公司；MIR-254恒溫培養箱，日本三洋電器股份有限公司。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化及致病性測定 采用組織分離法對病原菌進行分離，參照杜小琴等[17]的方法并略作修改，將常溫下自然發病的蓮藕按照病癥進行分組，切取4～5 mm病健交界處組織，在酒精中浸泡20 s，再用無菌水洗滌3次后置于PDA培養基中，每一病癥設置5個平行，在28℃恒溫培養箱中避光培養。以上操作均在無菌環境下進行。每天觀察其菌絲生長情況，用無菌接種環挑取菌落邊緣菌絲轉接至新的PDA培養基上，重復操作3～5次，直至菌落形態穩定。獲得的純培養物于4℃冰箱保存。病原菌致病性的測定采用針刺法。選取健康無機械損傷的蓮藕，清水沖去表面污泥，75%酒精表面消毒30 s，再用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺上晾干備用。將菌株活化后用無菌打孔器打取直徑約6 mm的菌餅，用無菌針刺破處理好的蓮藕，將病原菌接種至傷口內，以接種同體積的無菌PDA培養基為對照。將接種好的蓮藕置于經紫外照射處理過的聚乙烯PE袋進行包裝，28℃恒溫箱避光培養，定期觀察蓮藕發病情況。待發病后，按照1.3.1方法對病原菌再次進行分離，將2次分離得到的病原菌的菌絲及菌落形態進行對比，判斷兩者是否一致。

1.3.2 腐敗菌形態學及分子生物學鑒定 用打孔器在活化菌落邊緣打取直徑約6 mm的菌餅，轉接至新的PDA平板上，置于28℃恒溫培養箱中避光培養，每天觀察并記錄其菌落大小、形狀、顏色、菌絲密集度及擴展直徑，并在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態。腐敗菌基因組DNA的提取參照劉小玉等[18]的方法，將純化好的腐敗菌轉接于PDA平板上進行活化，待長出菌落后，用無菌接種環刮取少量菌絲于PDB培養基中，28℃搖床振蕩(120 r·min-1)培養48 h，用無菌濾紙過濾得到菌絲體，再用無菌水洗滌3～5次，濾紙吸干多余水分，收集菌絲0.1～0.3 g，使用液氮進行研磨，剩余操作按照DNA提取試劑盒說明書進行。對目的基因進行擴增，引物序列為：ITS1：5′-T C G T A G G T GA A C C T G C GG-3′，ITS4：5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′。引物合成委托杭州有康生物技術有限公司完成。PCR反應體系共25 μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、引物ITS1和ITS4各1 μL、模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。 按照說明書和設定PCR反應程序，其中延伸時間根據目的基因序列長度進行設定，退火溫度根據引物的Tm值進行設定。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，58℃復性15 s，72℃延伸15 s，35個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，PCR產物測序由杭州擎科梓熙生物技術有限公司完成。將測序所得序列在NCBI網站進行Blast在線比對，選取同源性較高的已知序列。利用BioEdit、MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構建菌株與親緣關系較近物種的系統發育樹，并結合菌株形態，確定菌株種屬。

1.3.3 腐敗菌生物學特性分析

1.3.3.1 不同培養溫度對菌絲生長的影響 設置5、10、15、20、25、30、35、40℃共8個培養溫度，在培養2 d的菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，轉接至新的PDA平板中央，每個處理溫度設置3個平行，28℃培養箱進行暗培養，48 h后采用十字交叉法測量病原菌得擴展直徑，并觀察記錄菌絲密集程度。

1.3.3.2 不同碳、氮源對菌絲生長的影響 以察氏固體培養基為基礎培養基，分別用等物質量的D-果糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和可溶性淀粉替代察氏固體培養基中的碳源，用等物質量的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、硫酸銨、硝酸銨和尿素替代基礎培養基中的氮源，兩者均以無碳氮源的培養基為空白對照，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.3 致死溫度測定 參照趙璐藐等[19]的方法，設置40、45、50、55、60、65、70℃共7個處理溫度，用打孔器從活化的菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，置于裝有5 mL無菌水的試管中，在以上設定溫度水浴加熱10 min,取出后迅速冷卻并接種于PDA平板上，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.4 不同光照條件及pH值對菌絲生長的影響 將病原菌接種到PDA培養基上，分別置于24 h持續光照、12 h光暗交替、24 h持續黑暗3個條件，設置4、5、6、7、8、9、10、11共8個pH值對病原菌的酸堿適應性進行測定，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.5 不同培養基對菌絲生長的影響 選取孟加拉紅培養基、蓮藕汁培養基、PDA、PCA以及清水瓊脂培養基(water agar，WA)共5個處理，其余方法同1.3.3.1。除測定不同溫度對菌絲生長的影響試驗時，將病原菌置于不同溫度的恒溫培養箱中，其余試驗均于28℃恒溫箱中進行。

1.4 數據處理與分析

試驗數據顯著差異性分析用SPSS 19軟件進行(P<0.05表示差異顯著)，采用GraphPad Prism8進行數據的處理和圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 腐敗菌的分離純化及致病性檢測

蓮藕在常溫貯藏條件下易發生腐爛，其自然發病癥狀為：貯藏第3天，蓮藕表面出現白色絨狀物，隨后蓮藕表面褐變，組織軟化、腐爛(圖1-A)。采用組織分離法，從腐爛部位共分離出3株真菌，分別標記為LO-1、 LO-2、 LO-3， 根據科赫氏法則[20]對分離出的真菌進行回接驗證，將病原菌分別接種至新鮮蓮藕上，只有LO-1能導致蓮藕腐爛，且腐爛部位分離得到的菌株與自然發病部位分離得到的菌株相一致(圖1-B)，從發病部位也可分離得到LO-1菌株，表明LO-1菌為蓮藕采后致腐病原菌。挑取菌落邊緣部位的菌絲對蓮藕致腐菌進行分離純化，病原菌培養2～3 d時，菌落呈白色絨毛狀，近圓形，氣生菌絲旺盛(圖1-C)，顯微鏡下觀察菌絲無隔(圖1-D)。培養7 d后，菌落開始變為淡綠色，隨著培養時間的延長，菌落逐漸變為黑色，培養至第14天時，菌絲出現有隔形態(圖1-E)。該菌產孢條件較為苛刻，在燕麥培養基上于28℃持續光照培養至第21天時，可觀察到該菌分生孢子器的產生，分生孢子器近球形或不規則形，分生孢子呈橢圓形或卵形，初期無隔膜，具縱紋，無色或透明，成熟后在近中部出現隔膜，整個孢子呈褐色，胞壁加厚(圖1-F)。

圖1 蓮藕貯藏期間果實發病癥狀、分離菌株菌落形態和孢子形態Fig.1 Diseases symptom on water bamboo shoot and morphology characteristics of colonies and spores of isolated strains

2.2 腐敗菌系統發育樹的分析

采用真菌通用引物，對分離得到的病原菌DNA進擴增，得到長度為 528 bp 的特異片段(圖 2-A)，對該 DNA 序列進行測序，將測序結果在 NCBI 上進行比對，選取同源性較高的序列，構建 LO-1 的系統發育樹，結果如圖 2-B所示。LO-1 的序列與可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae(登錄號：MK166047.1)的同源性較高，可達到 99.81%，兩者親緣關系最近的，在進化樹上聚為一類。將測序所得序列與其聚在同一分支上的物種序列對比結果如圖3所示，LO-1只有1個堿基與其親緣關系較近的物種的堿基序列不同。

注：M：分子量標記。Note：M: Marker.圖2 蓮藕采后分離病原菌 rDNA-ITS區PCR擴增產物的電泳結果及基于ITS基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Electrophoresis results on PCR products of rDNA-ITS from isolated strains and phylogenetic treeconstruted based on ITS gene sequence

圖3 ITS基因序列比對圖Fig.3 ITS gene sequence alignment map

2.3 蓮藕致腐真菌生物學特性分析

2.3.1 培養溫度和pH值對菌絲生長的影響 由圖 4-A可知，在培養基的pH值范圍為4～10 時，菌株均能生長，其中pH值范圍為 4～6 時，菌絲擴展直徑較大；pH值為5時，菌絲擴展直徑最大；pH值范圍為 8～10時菌絲擴展直徑較小，所以該菌在 pH值>10 時無法生長。最適生長 pH 值為 5(P<0.05)。培養溫度對菌絲生長的影響如圖4-B所示，該菌在10～35℃范圍內均能生長，最適宜的培養溫度為25℃，此溫度下培養2 d菌落直徑可達到80.01 mm，顯著高于其他處理(P<0.05)，在低于5℃或達到35℃以上菌絲不能生長，故該菌最適生長溫度為25℃。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate signifcant differences at 0.05 level. The same as following.圖4 不同pH值(A)、溫度(B)對菌株 LO-1生長的影響Fig.4 Effect of different pH value(A) and temperatures(B)on the growth of strain LO-1

2.3.2 不同碳、氮源對菌絲生長的影響 由圖5-A可知，該菌以蔗糖為碳源時生長較好，培養2 d菌落直徑可達76.75 mm，且菌絲生長迅速，長勢較好，相對其他碳源處理有顯著性差異(P<0.05)，其次為可溶性淀粉。由圖5-B可知，該菌以酵母浸出粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨為氮源時生長較好，四者間無顯著差異(P>0.05)，這4個處理的菌落直徑顯著高于其他氮源處理組(P<0.05)，其中以酵母浸出粉為氮源時，菌絲生長最為茂盛，菌絲直立，觸及培養皿蓋，表明酵母浸出粉最有利于該菌生長。

圖5 不同碳源(A)、氮源(B)對菌株 LO-1 生長的影響Fig.5 Effect of different carbon sources(A) and nitrogen sources (B)on the growth of strain LO-1

2.3.3 致死溫度測定 該菌經過40～70℃水浴處理10 min，結果發現(圖6)菌株LO-1在40～50℃處理后在PDA上能繼續生長，但隨著溫度的升高，菌絲的擴展直徑越來越小，菌絲分布也越來越稀薄，而55℃及以上溫度的各處理組，在培養7 d后仍未有菌絲長出，將該平板放于適宜該菌生長的條件下25℃培養7 d，仍未觀察到菌絲體的生長，說明該菌致死溫度為55℃(處理10 min)。

圖6 不同致死溫度對菌株LO-1生長的影響Fig.6 Effect of different lethal temperatures on the growth of strain LO-1

圖7 光照條件(A)和培養基(B)對菌株LO-1生長的影響Fig.7 Effect of light conditions(A) and different media(B) on the growth of strain LO-1

2.3.4 不同培養基及光照條件對菌絲生長的影響 在不同光照條件下培養2 d后對菌落直徑進行測定，由圖7-A可知，光照條件對LO-1菌絲生長的影響有顯著性差異，其中連續光照條件更有利于菌絲的延伸，黑暗條件下菌絲擴展直徑最小。培養至20 d時，12 h光暗交替及完全黑暗條件下均不產孢，而在連續光照條件下，培養至14 d便可觀察到孢子，說明持續光照有利于LO-1菌絲的生長，且能促進其產孢。不同培養基對LO-1生長的影響有顯著性差異(P<0.05)，在蓮藕汁-葡萄糖培養基中生長最好，培養2 d后菌落直徑達到51.95 mm，菌落生長平整、圓形，呈輻射狀，菌絲生長旺盛；其次是PDA培養基，該病原菌在PDA培養基上培養48 h后菌落直徑達43.84 mm。

3 討論

可可毛色二孢菌廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區，目前已知寄主達500種之多[21]，可引起果腐病、根腐病、枝枯病、褐腐病等，目前已報道的有龍眼焦腐病[22]、花生莖腐病[23]、藍莓枝枯病[24]、肉桂枝枯病[25]、橡膠樹回枯病[26]、高良姜葉枯病[27]等，同時也有研究發現可可毛色二孢菌是引起甘薯[28]和芋艿[29]等根莖類蔬菜腐敗的主要病原菌，但目前國內尚鮮見可可毛色二孢菌侵染引起蓮藕采后腐敗病的相關報道。

本研究通過對LO-1的生物學特性初步探究發現，該菌在10～35℃條件下均可生長，其中25℃最適合病原菌LO-1的生長，該菌的最適生長溫度與蓮藕采摘季節的溫度相近，這一研究結果與陳佳華[30]的報道相近，且在實際生產中具有一定的應用價值，一方面在蓮藕采摘時應盡量選擇氣溫較低的清晨或傍晚，可以有效鈍化病原菌的活性；另一方面采摘后的蓮藕應放置于低溫條件下進行貯藏，以此延長其保鮮期。菌株LO-1在pH值4～10條件下均可生長，最適pH值為5，更適宜在偏酸性環境下生長。而蓮藕多生長于偏酸性粘質土中，與該菌適宜生長的條件一致，這可能也是導致蓮藕易感染該菌的原因。在采后保鮮中可以考慮噴淋偏堿性保鮮劑來抑制蓮藕表面病原菌的生長，以此延長保鮮時間。LO-1病原菌可以利用蔗糖、葡萄糖等多種碳源，其中利用葡萄糖、乳糖、甘露糖的能力無顯著差異，對蔗糖的利用率最高，這與廖旺嬌等[31]在桉樹枝枯病上分離出來的LO-1菌的試驗結果一致；本研究結果發現該病原菌也可利用多種有機碳源和無機碳源，其中對酵母浸出粉的利用率最佳，這與董章勇等[32]報道的沙田柚果腐病可可毛色二孢無法利用尿素的結果不同，這可能是由于不同地區、不同物種所分離到的菌株的生物學特性、抗逆性、致病性以及菌落形態等方面均存在差異。在對LO-1菌絲體致死溫度的研究中發現，該菌致死溫度為55℃處理10 min，這與戴利銘等[33]的研究結果相似。以上研究結果說明LO-1具有較強的環境適應能力，可以利用多種碳源和氮源，且有較為廣泛的酸堿適應能力，因此無法簡單地通過改變外部環境條件來達到殺死病原菌的目的。今后的研究中應考慮選擇環保型保鮮劑對蓮藕進行保鮮。在研究不同培養基對該菌菌絲生長的影響時發現，在蓮藕汁-葡萄糖培養基上菌絲擴展直徑最大，說明蓮藕為該菌菌絲的生長提供了較為適宜的條件，也是蓮藕易感染該菌的原因之一。本研究還發現光照條件對LO-1菌絲的生長有顯著影響，光照可促進菌絲的生長，且可以促進孢子的產生，說明蓮藕采后避光保存可在一定程度上延緩其腐敗進程。而胡文軍等[26]研究發現光照條件對LO-1菌絲生長的影響不顯著，這可能是由于病原菌因寄主不同而導致的差異，具體情況還有待進一步研究?？煽擅呔漠a孢條件較為苛刻，在PDA培養基、不同碳氮源培養基以及不同pH值培養基中暗培養30 d均未觀察到孢子的產生，在燕麥培養基中連續光照培養，第14天方可觀察到少量孢子的產生，其具體產孢條件還需進一步研究。

4 結論

本研究采用組織分離法對常溫下自然腐爛的蓮藕進行病原菌的分離純化，得到LO-1、LO-2、LO-3 3種致腐真菌。根據科赫氏法則，確定蓮藕采后的主要致腐菌為LO-1，對該病原菌進行形態學及分子生物學鑒定，確定該菌為可可毛色二孢菌。通過對其生物學特性的研究發現，該菌最適生長溫度為25℃，在酸性條件下能較好地生長，在pH值為5時生長最好，菌絲致死溫度為55℃(10 min)，可利用多種碳氮源，其中最佳碳源為蔗糖，最佳氮源是酵母浸出粉。在多種培養基上都能生長，其中在蓮藕汁-葡萄糖培養基上菌絲生長最茂盛。光照條件對該菌菌絲的生長有一定的影響，連續光照可促進其生長，該菌產孢條件較為苛刻，只有在燕麥培養基且持續光照的條件下才有少量孢子產生。