基于生物信息學檢測NSUN2 基因在膠質瘤中的表達及臨床意義

張 群，田秋思，唐鋮鋮，馮 光，路宏朝

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.三二〇一醫院神經外科，陜西 漢中 723000）

人腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，預后差，其中以多形性膠質瘤（glioblastoma multiforme，GBM）惡性程度最高，患者總生存時間僅10～15 個月[1]。人腦膠質瘤的發病機制非常復雜，具體機制仍不清楚。相關基因表達異常在人腦膠質瘤尤其是NSUN2 的發生、發展中起著至關重要的作用[2]。因此，篩選人腦膠質瘤特異且敏感的差異表達基因有助于認識人腦膠質瘤，同時有利于人腦膠質瘤的早期診斷和精準治療。5-甲基細胞嘧啶（m5C）通過RNA 代謝調節，特別是RNA 穩定性、RNA 導出RNA、mRNA 翻譯和RNA 處理參與腫瘤的發生[3，4]。NOP2/Sun 結構域家族成員2（NSUN2）也被稱為MYC 誘導的SUN 結構域含蛋白（Misu），是催化m5C 形成的主要m5C 修飾酶。根據免疫組化學（IHC）分析，NSUN2 在各種腫瘤中均高度表達，包括食管、肝臟、胰腺、子宮頸、腎、胃、甲狀腺和乳腺癌[5-8]。研究表明[4]，NSUN2 通過與其3'-UTR 中的m5C 修飾位點結合穩定HDGF癌基因的mRNA 來促進膀胱癌的進展。然而，關于NSUN2 在神經膠質瘤中的作用的研究還很少。本研究使用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據集分析NSUN2 基因在正常腦組織與GBM 中的表達差異，以及NSUN2 與GBM 患者臨床病理特征的相關性，旨在為深入研究GBM 的靶向治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源 從TCGA（https:/lcancergenome.nih.gov/）數據庫下載GBM 的mRNA 表達譜數據，包含1150 例正常腦組織和689 例GBM 組織，同時下載對應的患者臨床資料，采用R 軟件和Perl 語言預處理數據。

1.2 數據集篩選和差異表達分析 剔除TCGA 數據集中臨床病理參數不完整及缺乏預后隨訪資料的樣本，僅保留同時包含臨床參數和生存數據的樣本，利用Wilcoxon 秩和檢驗確定NSUN2 基因在正常腦組織和GBM 組織中的表達差異，采用R 軟件（3.5.2）的“limma”軟件包完成差異分析并繪制差異散點圖[9]。

1.3 生存分析與臨床相關性分析 根據樣本中NSUN2 基因表達的中位值將NSUN2 分為高表達組和低表達組，采用R 軟件的“survival”軟件包進行生存分析，采用“survminer”軟件包繪制生存曲線，單因素和多因素Cox 風險模型分析臨床參數與GBM 預后的關系，并計算風險比（hazard ratio，HR）。

1.4 基因集富集分析 采用CSEA 軟件（4.0.2）（http:/lsoftware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）進行富集分析。采用CSEA 網站的MsigDB 數據庫獲取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數據集，設置分析置換次數為1000 次，顯著富集基因集需滿足以下條件：錯誤發現率（false discovery rates，FDR）＜0.25，P＜0.05。

1.5 mRNA 和蛋白質表達驗證實驗 選取符合納入和排除標準9 例膠質瘤組織與癌旁正常組織標本作為本實驗的驗證對象。納入標準：在西安交通大學附屬三二〇一醫院明確診斷為GBM 的患者；IBM為18.5～25 kg/m2；年齡20～65 歲。排除標準：存在嚴重的心、肺、腎等嚴重的內科合并癥；臨床資料不完整。按照Trizol 試劑說明書提取細胞總RNA 后，采用逆轉錄試劑盒（Accurate）進行RNA 逆轉錄實驗。逆轉錄后的cDNA 用于進行實時熒光定量實驗，以小鼠GAPDH 作為內參。同時，選取的5 例患者標本所制作的5 組GBM 組織和癌旁組織的石蠟切片，將5 組患者膠質瘤與癌旁標本通過三步法進行NSUN2 作為一抗的免疫染色，觀察免疫染色后的陽性結果的表達，本實驗采用DAB 染色，陽性結果顯色為黃褐色。其中一抗采用Cell Signaling Technology 的NSUN2 兔源多克隆抗體。引物序列見表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用（）表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用單因素和多因素Cox 回歸分析挑選預后相關因子，相關性分析采用皮爾森相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSUN2 在GBM 組織中的表達情況 NSUN2 在GBM 組織中的表達高于正常腦組織，差異有統計學意義（P<0.05）﹐見圖1。

圖1 NSUN2 在GBM 組織中的表達情況

2.2 NSUN2 表達情況與GBM 患者臨床病理特征的關系 NSUN2 表達與GBM 患者預后呈負相關，見圖2。不同年齡、臨床分期、TP53 分型的GBM 患者NSUN2 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），不同性別的GBM 患者NSUN2 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。單因素Cox 回歸分析顯示，NSUN2 mRNA 的高表達、WHO 分級、應答深度、1p/19q 雜合性缺失以及IDH1 基因野生型可降低患者的總生存期，性別與患者預后無關；將上述有統計學意義的因素納入多因素的Cox 回歸模型分析，結果顯示治療結果、IDH1 基因野生型和年齡是患者總生存期的獨立影響因素，見表2。

表2 GBM 預后影響因素的單因素、多因素Cox 回歸分析

圖2 NSUN2 基因mRNA 表達與GBM 患者預后的相關性

圖3 NSUN2 表達與臨床病理特征的關系

2.3 基因集富集分析 GSEA 分析結果表明，NSUN2基因高表達組GBM 樣本主要富集于視網膜母細胞瘤、合成蛋白、整合素、反應性膠原形成信號通路，見圖4。

圖4 NSUN2 相關富集基因集

2.4 NSUN2 mRNA 在GBM 組織中的表達情況q-PCR實驗顯示，NSUN2 mRNA 的表達在GBM 組織中上調，見圖5，其中NSUN2 mRNA 在GBM 組織中的表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。IHC 實驗結果顯示，NSUN2 在GBM 組織呈中等程度的胞核陽性，且NSUN2 mRNA 在GBM 組織的表達水平高于癌旁組織，見圖6。

圖5 NSUN2 mRNA 在GBM 組織和癌旁組織的表達比較

圖6 NSUN2 蛋白在GBM 組織和癌旁組織的表達比較

3 討論

本研究顯示，NSUN2 在GBM 中的表達高于癌旁組織組，NSUN2 高表達組的總生存期低于低表達組（P＜0.05），提示NSUN2 高表達是GBM 患者預后的危險因素。另外，本研究采用qPCR 技術和IHC 實驗驗證了膠質瘤組織中NSUN2 表達上調。有報道顯示，包括NSUN2 在內的幾種RNMT 的表達在DNA拷貝數和mRNA 表達之間具有正相關性，并且與乳腺癌患者的更高級別侵襲性亞型和不良預后相關[10]。在皮膚癌中，NSUN2 的表達缺失與惡性腫瘤的增加相關[11]。在卵巢癌中，NSUN2 低表達和IGF2 高表達的患者具有較差的總體和無疾病進展生存率，因此NSUN2/IGF2 信號已被確定具有預后生存價值[12]。另有研究發現，NSUN2 在頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）中的表達上調約2 倍，這與患者的總生存期縮短和較高的死亡率風險相關[13]。此外，NSUN2 高表達與HNSCC 中的T 細胞活化相關，NSUN2 低表達患者的T 細胞活化評分與死亡率之間存在正相關，這表明HNSCC 中NSUN2 表達可作為免疫檢查點的標志物[14]。有研究明確了NSUN2 在胃癌中的作用，發現NSUN2 通過以m5C 依賴的方式抑制細胞周期蛋白依賴性激酶p57Kip2，在體外和體內促進癌細胞增殖[15]。這些研究均證明了NSUN2 在腫瘤中的重要作用，但NSUN2 在膠質瘤中的作用還需要進一步闡明。

本研究中，單因素和多因素Cox 的分型顯示，NSUN2 和病理分級在GBM 中是兩個獨立預后因子。在與GBM 患者臨床特征關系的研究中發現，不同年齡、病理分級﹑性別以及腫瘤分期的GBM 患者NSUN2 表達均有差異。進一步對NSUN2 高低表達組進行差異分析，并對所得的差異基因進行功能富集﹐發現差異基因主要和整合素及蛋白聚糖相關通路有關，這也提示蛋白代謝可能參與GBM 的發生發展。蛋白質合成是所有細胞的基本過程，但其在發育、干細胞和癌癥中的精確調控作用尚不清楚。研究顯示，NSUN2 在m5C 轉錄后甲基化轉移RNA（TRNA）是一種新的抑制蛋白質合成的機制[16，17]。NSUN2 的缺失導致tRNA 的低甲基化，使血管生成素能夠內切tRNA，并積累5'tRNA 片段[16-19]，這些片段可抑制帽依賴的蛋白質翻譯[20-22]，這與GSEA 富集的結果一致。還有研究顯示[23]，NSUN2 基因雙等位基因功能的缺失變異與青少年白內障或腦異常疾病相關，提示NSUN2 與GBM 存在的相關性。GSEA 分析顯示，NSUN2 高表達組在視網膜母細胞瘤相關通路中有顯著富集。

綜上所述，GBM 組織中NSUN2 基因呈高表達狀態，并且與患者的臨床病理特征密切相關，可以為GBM 診斷和治療的提供新思路。