血清外泌體中miR-155與兒童癲癇相關性分析

林銀花 馮冉冉 馮琳琳 孫勇 王蕾

262100 山東省安丘市人民醫院兒科1，山東濰坊

272000 濟寧市第一人民院新生兒科2，山東濟寧

271000 泰安市中心醫院兒科3，山東泰安

266000 青島西海岸新區人民醫院4，山東青島

癲癇是一種神經系統類疾病，極其具有破壞性，嬰幼兒、兒童是高發人群。相關醫學統計數據顯示[1]，癲癇的終身患病率為1%，兒童、中老年人是高發人群，現階段，在全球范圍內，診斷有癲癇存在的病例數達到了240萬人左右。1 d以上發生至少3次無端發作病史、10年內有60%以上并發可能性存在是臨床診斷癲癇過程中采用的傳統依據[2]。本研究分析了兒童癲癇患兒血清外泌體中miR-155 的表達及臨床意義，現報告如下。

資料與方法

選取2020年2月-2021年2月癲癇患兒50例，作為癲癇組，另選取同期健康體檢兒童50 例，作為健康組。癲癇組女23例(46.00%)，男27例(54.00%)；年齡2～14 歲，平均(8.32±1.42)歲。健康組女22 例(44.00%)，男28 例(56.00%)；年齡3～15 歲，平均(8.62±1.62)歲。兩組患兒一般資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經過倫理委員會批準，且患兒家屬均簽署知情同意書。

納入標準：①均經核磁共振成像(MRI)、頭部電子計算機斷層掃描(CT)等影像學檢查確診為原發性癲癇[3]；②距離最近一次發作時間均在1 周以內。

排除標準：①有腦梗死、腦發育畸形等器質性病變；②有癲癇家族史；③近期有腦外傷。

方法：①血清標本收集：清晨將兩組兒童的5 mL靜脈血采集下來，放置在室溫下，3 h內離心10 min，速率3 000 r/min，將上清液吸取出來，在EP 管中放置，并保存在-80℃的冰箱中。②血清外泌體提?。簭?80℃冰箱中拿出血清，在冰上放置溶解，充分溶解血清后用無RAN酶槍頭將800 μL從每份血清中吸取出來，向1.5 mL EP管(無RNA 酶)中轉移。在4℃的溫度下以300 r/min的速率離心10 min，將分離的細胞除去。將上清液收集起來，用0.22 μ m Merck Millipore濾膜過濾，將污染的細胞碎片、微囊小泡、凋亡體除去。用Optima TM L-80XP Ultracentrifuge，Beckman Coulter 離心機分離澄清的上清液，在4℃的溫度下以100 000 g/min 的速率離心1.5 h。制作外泌體為小球。小心除去上清液，合并包含外泌體的小球并在1 mL的冰PBS中重懸，然后進行第二次超速離心，在4℃的溫度下以100 000 g/min的速率離心1.5 min，旋轉體類型同上，在500 μL PBS中重懸產生的外泌體小球。③外泌體miR-155表達測定：運用qRT-PCR法，首先提取外泌體miRNA，依據血清miRNA 提取試劑盒說明書將血清外泌體miRNA 提取出來，用Nanodrop 對miRNA 濃度進行測定。然后進行逆轉錄反應，應用逆轉錄試劑盒逆轉錄miRNA為cDNA，程序為在37℃、85℃的溫度下分別逆轉錄1 h、5 min，在42℃溫度下5 min結束逆轉錄反應后第一時間取出cDNA 產物，以較快的速度在冰上放置冷卻，在冰上進行所有后續步驟，不能隨便從冰上移走cDNA。最后運用探針法制備定量PCR 反應mix。10倍稀釋上述步驟產生的cDNA，在專用PCR 管中放置，將10μL 2×real-time PCR Master Mix+0.4μL Gene specific Primer set+0.2μL Gene specific Probe+0.2 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)+2.0μL RT product+7.2 μL ddH2o (RNase-free)組成的反應體系配制出來。qRT-PCR反應程度為在95℃、95℃、62℃的溫度下分別預變性、變性、退火延伸3 min、12 s、12 s，退火延伸過程中將熒光信號采集下來。將內參設定為U6，將三個復孔在每個樣品中設立出來，目標基因的相對表達量用2-△△Ct表示。

觀察指標：①兩組兒童血清外泌體miR-155表達水平；②兒童癲癇早期診斷中miR-155的價值。采用SPSS 軟件繪制ROC 曲線，敏感度、1-特異度分別為縱坐標、橫坐標。

統計學方法：數據使用SPSS 20.0 統計學軟件分析；計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗，重復測量的計量資料進行方差分析；計數資料以(%)表示，比較采用χ2檢驗；兒童癲癇早期診斷中miR-155 的價值評定用受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積(AUC)。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

兩組兒童血清外泌體miR-155表達水平比較：癲癇組血清外泌體miR-155表達水平為(2.25±0.32)nm，高于健康組的(1.14±0.30)nm，差異有統計學意義(P＜0.05)。

兒童癲癇早期診斷中miR-155 的價值分析：AUC=0.811，診斷臨界值為1.490 時，敏感度、特異度分別為83.30%、7.00%。見圖1。

圖1 miR的ROC曲線

討 論

癲癇屬于一種神經系統性疾病，兒童是高發人群。世界衛生組織資料顯示，國際上240 萬/年確診癲癇病例中，小兒癲癇占約70%[4]。在兒童癲癇的診斷中，雖然基因檢測、腦電圖、腦成像等技術具有輔助診斷價值，但是仍然具有偏高的誤診率[5]。在腦部疾病的診斷中，miRNA 是一種新型潛在生物標志物，內源性核糖核酸酶不會對其造成不良影響。相關醫學研究表明，血清miRNA 在癲癇患者中變化明顯[6]。外泌體是納米級囊泡，主要由脂類雙分子膜包裹形成，能夠將30～100 nm 直徑的各類細胞分泌出來，攜帶脂質、蛋白質、miRNA 等物質，將對廢物進行管理、細胞內通訊、將各方面凝聚起來等作用發揮出來。

相關醫學學者以上述理論為指導，對小兒癲癇診斷中血清外泌體miR-155 的應用價值進行了探討，發現血清外泌體miR-155 微囊泡直徑在30～100 nm，能夠將小兒癲癇患兒血清中成功將外泌體分離出來。同時，小兒癲癇組患兒的血清外泌體miR-155 水平顯著高于健康兒童。此外，去除外泌體后血清懸浮液中miR-155 含量也在極大程度上上調。實時定量PCR 方法證實，小兒癲癇患兒具有較高的血清外泌體miR-155 表達，能夠將有力依據提供給臨床診斷工作[7-8]。本研究結果表明，癲癇組患兒的血清外泌體miR-155 表達水平高于健康組，差異有統計學意義(P＜0.05)。采用SPSS軟件將ROC 曲線繪制出來，敏感度、1-特異度分別為縱坐標、橫坐標。AUC=0.811，診斷臨界值為1.490 時，敏感度、特異度分別為83.30% 、7.00%，和上述研究結果一致，說明在小兒癲癇診斷中，血清外泌體miR-155 分離鑒定與表達能夠將有效依據提供給臨床。

綜上所述，兒童癲癇患兒血清外泌體中miR-155表達升高，能夠為臨床早期診斷兒童癲癇提供有效依據，其可能在癲癇的發病中參與，在表達超過1.490時，提示可能發生癲癇。