建立術(shù)后腸梗阻大鼠模型的新方法及評(píng)價(jià)

李倩 莫黎 何永恒

術(shù)后腸梗阻是腹部外科手術(shù)后早期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1]，以惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、排氣時(shí)間延長(zhǎng)及腸鳴音異常為主要臨床表現(xiàn)[2]，其發(fā)病率可高達(dá)17%～20%，尤其以腸道手術(shù)后更為常見(jiàn)[3]。術(shù)后腸梗阻癥狀通常持續(xù)2～4 d，有時(shí)甚至?xí)L(zhǎng)達(dá)7 d以上，部分患者（尤其是經(jīng)腸吻合后的患者）腸梗阻時(shí)間會(huì)顯著延長(zhǎng)[4]，術(shù)后腸梗阻治療周期長(zhǎng)、恢復(fù)慢，患者術(shù)后住院時(shí)間延長(zhǎng)使患者和社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)增加[5]。目前該疾病的主要治療策略是在常規(guī)腹部外科手術(shù)后治療的基礎(chǔ)上減輕胃腸負(fù)擔(dān)（如禁食及使用鼻胃管等），針對(duì)性的治療措施少，因此理想術(shù)后腸梗阻造模方式的建立有著重要意義。目前國(guó)內(nèi)外主要采用Kalff教授[6]及王李教授[7]的方法，即通過(guò)摩擦小腸來(lái)建立術(shù)后腸梗阻模型，但其與臨床實(shí)際情況尚有差距，因此本實(shí)驗(yàn)研究了不同造模方法對(duì)SD大鼠術(shù)后胃腸動(dòng)力及血清IL-6、TNF-α水平的影響，旨在建立操作便捷、能真實(shí)模擬臨床腹部手術(shù)術(shù)后腸梗阻且重復(fù)性好的動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體重（200±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：[SYXK（湘）2016-0002]。購(gòu)入后于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，所有針對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)條例，本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：LL2019092005）。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒由上海晶天生物提供，生產(chǎn)批號(hào)分別為E20200103010、E20200103012。

1.3 動(dòng)物分組及建模方式 將60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型A、B、C、D組、假手術(shù)組和空白組，每組10只。模型A、B、C、D組和假手術(shù)組大鼠手術(shù)前均禁食24 h，不禁飲，術(shù)后禁食不禁飲，麻醉方式為10%水合氯醛（0.25 ml/100 g）腹腔注射。模型A組開(kāi)腹后以沾有0.9%氯化鈉溶液棉簽自小腸近心端向遠(yuǎn)心端擦拭3次，手術(shù)后順序還納腸管；模型B組開(kāi)腹后提出盲腸，結(jié)扎并切除部分盲腸；模型C組結(jié)扎并切除部分盲腸，再以0.9%氯化鈉溶液棉簽行小腸擦拭1次；模型D組結(jié)扎并切除部分盲腸后，再于小腸中部離斷，以3-0可吸收線間斷全層縫合小腸；假手術(shù)組開(kāi)腹后靜置20 min關(guān)腹；空白組不予手術(shù)處理。

1.4 取材及檢測(cè) 所有大鼠術(shù)后23.5 h均給予0.15 ml活性炭溶液灌胃，0.5 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。

1.4.1 血清IL-6、TNF-α水平檢測(cè) 大鼠麻醉后將其固定，心尖采血，靜置 1 h后，4 000 r/min、4℃離心 15 min，取上清液，干冰即時(shí)冷凍保存，采用ELISA法檢測(cè)血清 IL-6、TNF-α 水平。

1.4.2 胃腸推進(jìn)率及胃殘留物質(zhì)量檢測(cè) 開(kāi)腹后，輕柔分離展開(kāi)腸管，夾閉胃賁門(mén)、幽門(mén)及回腸下端，計(jì)算胃腸推進(jìn)率（胃腸推進(jìn)率=小腸染黑長(zhǎng)度/全小腸長(zhǎng)度×100%），并分離胃體測(cè)量胃殘留物質(zhì)量（胃殘留物質(zhì)量=全胃重量-洗凈后胃體重量）。

1.4.3 小腸病理切片觀察 靠近幽門(mén)取2 cm近端小腸腸管，0.9%氯化鈉溶液洗凈后以4%多聚甲醛固定液固定，用于 HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，滿(mǎn)足方差齊性的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不滿(mǎn)足方差齊性的計(jì)量資料則應(yīng)用Welch檢驗(yàn)，多重比較采用Tamhane's T2檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)分析胃腸推進(jìn)率與血清IL-6、TNF-α水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 術(shù)后24 h，空白組 IL-6、TNF-α 水平均明顯小于模型 A、B、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；模型C、D組IL-6、TNF-α水平均明顯高于模型A、B組、假手術(shù)組、空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 6組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（ng/L）

2.2 6組大鼠胃腸推進(jìn)率、胃殘留物質(zhì)量比較 術(shù)后24 h，空白組胃腸推進(jìn)率均明顯高于模型A、B、C、D組，胃殘留物質(zhì)量均明顯低于模型B、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；模型C、D組胃腸推進(jìn)率均明顯低于模型A組、假手術(shù)組、空白組，胃殘留物質(zhì)量均明顯高于模型A組、假手術(shù)組、空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），其中模型C組胃腸推進(jìn)率明顯低于模型A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 2。

表2 6組大鼠胃腸推進(jìn)率及胃殘留物質(zhì)量比較

2.3 6組大鼠小腸病理切片觀察 模型A、B組的腸黏膜壞死、脫落；模型C、D可見(jiàn)黏膜壞死、脫落并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；空白組及假手術(shù)組腸黏膜上皮排列有序，絨毛結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)損傷，見(jiàn)圖1。

圖1 6組大鼠小腸病理切片所見(jiàn)（a：空白組；b：假手術(shù)組；c：模型A組；d：模型B組；e：模型C組；f：模型D組；HE染色，×200）

2.4 大鼠胃腸推進(jìn)率與血清IL-6、TNF-α水平的相關(guān)性分析 大鼠胃腸推進(jìn)率與血清IL-6水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P＜0.01），與血清 TNF-α 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.79，P＜0.01），見(jiàn)圖 2、3。

圖2 胃腸推進(jìn)率與血清IL-6水平關(guān)系的散點(diǎn)圖

圖3 胃腸推進(jìn)率與血清TNF-α水平關(guān)系的散點(diǎn)圖

3 討論

現(xiàn)代研究普遍認(rèn)為術(shù)后腸梗阻大致有兩個(gè)不同的階段：（1）以過(guò)度抑制反應(yīng)為特征的短暫神經(jīng)介導(dǎo)階段；（2）較長(zhǎng)的炎癥反應(yīng)階段[8]。而炎癥反應(yīng)在術(shù)后腸梗阻的后續(xù)維持階段起關(guān)鍵作用[9]。在20世紀(jì)90年代后期，研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)操作會(huì)引發(fā)白細(xì)胞在相應(yīng)腸段中的流入，損害發(fā)炎腸管的收縮能力，導(dǎo)致腸管持久性運(yùn)動(dòng)障礙[10-11]。之后，許多研究結(jié)果表明肥大細(xì)胞在術(shù)后腸梗阻的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，如術(shù)后腸梗阻模型小鼠的腹腔液中肥大細(xì)胞蛋白酶-I水平顯著增加，且腸肌層有明顯的炎性浸潤(rùn)，而用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑酮替芬預(yù)處理小鼠能夠防止腸肌層的炎性細(xì)胞募集，并且可改善手術(shù)后小鼠的胃排空現(xiàn)象[12]；肥大細(xì)胞缺陷型術(shù)后腸梗阻小鼠也同樣表現(xiàn)出手術(shù)后炎癥反應(yīng)減弱的現(xiàn)象[13]。而在結(jié)腸切除術(shù)后發(fā)生術(shù)后腸梗阻患者中，肥大細(xì)胞的激活也有明顯增加[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞和常駐巨噬細(xì)胞也與腸管炎癥反應(yīng)有關(guān)[10]。而腸壁內(nèi)相關(guān)細(xì)胞的激活，部分由與損傷相關(guān)的分子模式和病原體相關(guān)的分子模式引起，前者是響應(yīng)機(jī)械釋放的大分子或化學(xué)細(xì)胞損傷（例如腸管的手術(shù)操作），后者是由與炎癥相關(guān)的滲透性增加而通過(guò)腸壁移位所引起，網(wǎng)絡(luò)狀分布的常駐巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞活化后，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1B、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等的分泌，組織隨后進(jìn)入細(xì)胞炎癥期，大量的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)入肌層，進(jìn)而導(dǎo)致腸管收縮力受損[1]。而在臨床中術(shù)后腸梗阻患者的血清IL-6以及TNF-α水平較術(shù)前均有明顯升高[15]，因此本研究中選取此兩種促炎細(xì)胞因子作為模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

目前國(guó)內(nèi)外術(shù)后腸梗阻動(dòng)物模型的建立主要承自Kalff教授建立的模型制造方法：開(kāi)腹后，將小腸移出腹腔，以0.9%氯化鈉溶液濕潤(rùn)棉簽或紗布擦拭小腸腸管表面，再按順序還納腸管，關(guān)腹。擦拭的具體操作各個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目略有不同，有以時(shí)間記，5～20 min不等；有以次數(shù)記，3～5次不等；方向均為近端至遠(yuǎn)端，模擬腹部手術(shù)造成的腹腔內(nèi)的刺激。傳統(tǒng)的造模方式雖然操作簡(jiǎn)單，但沒(méi)有模擬腸管離斷對(duì)機(jī)體的刺激，而研究表明術(shù)后5 h，腸管切口處附近肌肉會(huì)出現(xiàn)電慢波和相性收縮，這個(gè)現(xiàn)象會(huì)隨著切除上下距離的增加而減少[16]。因此腸管離斷對(duì)胃腸動(dòng)力的影響是實(shí)際存在且不能忽視的，且其單純對(duì)小腸進(jìn)行手術(shù)操作，忽略了腹部空腔臟器吻合帶來(lái)的感染風(fēng)險(xiǎn)。

本研究綜合了以往的造模方式并結(jié)合臨床實(shí)際情況，創(chuàng)新地建立了幾種手術(shù)造模方式：模型B組盲腸結(jié)扎并切除；模型C組盲腸結(jié)扎并切除后以0.9%氯化鈉溶液棉簽擦拭小腸1次；模型D組首先部分盲腸切除，縫扎閉合遠(yuǎn)端，然后在小腸中部離斷行腸管吻合術(shù)。根據(jù)術(shù)后腸梗阻的臨床特征及現(xiàn)有的機(jī)制研究結(jié)果，本研究團(tuán)隊(duì)選取了血清IL-6、TNF-α水平、胃腸推進(jìn)率及胃殘留物質(zhì)量作為主要檢驗(yàn)指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，術(shù)后24 h，空白組胃腸推進(jìn)率均明顯高于模型A、B、C、D組，胃殘留物質(zhì)量均明顯低于模型B、C、D組，模型C、D組胃腸推進(jìn)率均明顯低于模型A、假手術(shù)、空白組，胃殘留物質(zhì)量均明顯高于模型A、假手術(shù)、空白組，其中模型C組胃腸推進(jìn)率高于模型B組，證明盲腸切除手術(shù)操作對(duì)胃腸推進(jìn)率的影響要大于傳統(tǒng)的小腸擦拭法，且C組能更好的模擬臨床腹部手術(shù)患者術(shù)后的胃腸功能顯著減低的狀態(tài)；術(shù)后24 h，各模型組血清IL-6水平均明顯高于空白組，與郭薇等[17]研究結(jié)果一致。在各組小腸病理切片觀察中也發(fā)現(xiàn)，各模型組均可見(jiàn)腸黏膜壞死、脫落及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以模型C、D兩組最為明顯。再?gòu)牟僮鞅憬荻葋?lái)看，模型A組為傳統(tǒng)造模方法，操作較為復(fù)雜，在多次擦拭小腸的過(guò)程中容易出現(xiàn)漿膜損傷及血管斷裂等情況，且模型的重復(fù)性不佳，易出現(xiàn)個(gè)體差異，而盲腸切除的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，模型D組雖然也能較好的模擬術(shù)后腸梗阻，但手術(shù)難度較高，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因出現(xiàn)吻合口瘺導(dǎo)致大鼠死亡1例，不適合推廣。

綜合來(lái)看，模型C組在胃腸動(dòng)力及促炎細(xì)胞因子等方面很好地模擬了臨床實(shí)際情況，且造模方式便捷，減少了擦拭過(guò)程中的意外，采用盲腸切除術(shù)更貼近于胃腸道手術(shù)術(shù)后腸梗阻的動(dòng)物模型；此外，盲腸切除+小腸擦拭1次的造模方式使得操作刺激量更加可控，此方法操作便捷度好，模型重復(fù)性好，適合推廣應(yīng)用。