基于細胞焦亡與炎癥反應相關基因構建肝細胞癌預后風險評估模型及驗證

應樂倩 王德強 余暉 李小琴

肝細胞癌惡性程度高、預后差，且其發病率在全球范圍內居高不下[1]。免疫檢查點抑制劑的出現為肝細胞癌的治療開辟了新途徑，但由于缺乏理想的靶點，因此治療上缺乏個體化的用藥指導。同時，細胞焦亡這一新的細胞死亡方式被揭示，其本質上是一場機體的“炎癥風暴”，可激活免疫反應[2]。研究顯示細胞焦亡與胃癌、肺癌以及結直腸癌等疾病有關，能影響抗腫瘤藥物的療效[3-8]。因此，本文基于細胞焦亡與炎癥反應相關基因構建肝細胞癌預后風險評估模型，得到細胞焦亡與炎癥反應評分（pyroptosis and inflammatory response score,PIRS），并進一步探索PIRS對腫瘤微環境（tumor microenvironment,TME）狀態的預測效能，以期為肝細胞癌的預防和診治提供新思路和新靶點。

1 材料和方法

1.1 數據來源 mRNA數據和臨床信息從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數據庫（https://cancergenome.nih.gov）和國際癌癥基因組聯盟（international cancer genome consortium,ICGC）數據庫（https://dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP）獲得[9]。納入標準：（1）可通過mRNA數據計算PIRS；（2）符合肝細胞癌病理診斷；（3）年齡、性別、總生存期（overall survival,OS）、組織學分級以及病理學分期等臨床數據完整。最終從TCGA數據庫和ICGC數據庫分別篩選出365例和231例肝細胞癌患者。查閱相關文獻提取細胞焦亡相關基因[3-8]，并從基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）數據庫（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載炎癥反應基因集。

1.2 肝細胞癌預后風險評估模型構建 使用R語言的limma包提取出TCGA數據庫中245個細胞焦亡和炎癥反應基因的mRNA數據。采用單變量Cox回歸分析篩選與OS顯著相關基因，計算HR和95%CI。通過Kaplan-Meier生存分析得到其最佳截斷值，將mRNA數據進行二分類轉換：低表達組為0，高表達組為1。最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator,Lasso）Cox回歸分析得到回歸系數，其絕對值定為＞0.2，構建由15個基因組成的肝細胞癌預后風險評估模型。通過模型公式計算出PIRS，并通過其在TCGA數據庫的中位值（0.2）分別將TCGA數據庫和ICGC數據庫中患者分為高風險組和低風險組。

1.3 模型的有效性驗證 Kaplan-Meier生存分析比較兩組患者的預后。通過AUC比較PIRS預測患者預后的準確性。通過prcomp函數進行主成分分析（principal components analysis,PCA），對高低風險樣本分類進行降維模擬。通過單因素和多因素Cox回歸分析研究PIRS與肝細胞癌臨床病理特征間的關系。

1.4 評估TME狀態以及機制探索 通過單樣本GSEA（single sample GSEA,ssGSEA）計算出免疫浸潤細胞的含量和免疫相關通路的活性[10]。基于腫瘤免疫功能障礙與逃逸（tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）網站（http://tide.dfci.harvard.edu/）已有的免疫治療數據，上傳肝細胞癌患者表達譜數據預測TME的狀態。通過前期收集TCGA數據庫的免疫景觀圖譜，研究者已將所有TCGA樣本分為C1～C6免疫亞型[11]，分別為創傷愈合型、IFN-γ為主型、炎癥反應型、淋巴細胞耗竭型、免疫沉默型和轉化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）為主型。從分子標簽數據庫網站（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）下載京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）和基因本體論（gene ontology,GO）數據庫，通過GSEA提取細胞焦亡與炎癥反應相關的信號通路以及生物學功能。

1.5 統計學處理 采用R 4.0.3（www.r-project.org）統計軟件。基因表達與患者預后的關系分析采用Kaplan-Meier生存分析，兩組生存率比較采用logrank檢驗。不同臨床病理分期患者的基因表達水平比較采用單因素與多因素Cox回歸分析。計量資料兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌預后風險評估模型的構建 在TCGA數據庫中，通過對245個細胞焦亡與炎癥反應基因的mRNA數據進行單變量Cox回歸分析和Kaplan-Meier生存分析比較預后，篩選出與OS顯著相關的62個基因（P＜0.05，圖1a，見插頁）。因為速激肽受體3（tachykinin receptor 3,TACR3）基因的HR值高達211，為排除不同數據庫之間存在的測量誤差，TACR3基因不參與預后模型的構建。采用Lasso Cox回歸分析確定15個基因參與模型構建（圖1b，見插頁），其中C-C基序趨化因子受體（C-C motif chemokine receptor 7,CCR7）、顆粒酶 A（granzyme A,GZMA）、HPN（hepsin）、白細胞介素18受體輔助蛋白（interleukin 18 receptor accessory protein,IL-18RAP）、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor,IL-7R）和核苷酸寡聚結構域樣受體家族含pyrin結構域 6（the nucleotide oligomerization domainlike receptor family pyrin domain containing 6,NLRP6）為保護因素；而C-C基序趨化因子配體20（C-C motif chemokine ligand 20,CCL20）、GSDMC（gasdermin C）、早老蛋白-1（presenilin-1,PSEN1）、金屬蛋白酶 α（meprin α,MEP1A）、核苷酸寡聚結構域 2（nucleotide oligomerization domain 2,NOD2）、整合素亞基 α5（integrin subunit α5,ITGA5）、ras同家族 G（ras homolog family G,RHOG）、集落刺激因子3受體（colony stimulating factor 3 receptor,CSF3R）和白細胞介素15受體亞基α（interleukin-15 receptor subunit α,IL-15RA）為危險因素（圖1c，見插頁）。根據模型公式計算每個患者的風險評分：PIRS=（-0.452）×CCR7 值+（-0.404）×GZMA 值+（-0.561）×HPN 值+（-0.710）×IL-18RAP 值+（-0.514）×IL-7R 值+（-0.385）×NLRP6 值+（0.332）×CCL20 值+（0.402）×GSDMC 值+（0.419）×PSEN1+（0.445）×MEP1A值 +（0.515）×NOD2 值 +（0.516）×ITGA5 值 +（0.601）×RHOG 值+（0.602）×CSF3R 值+（0.759）×IL-15RA 值。

圖1 肝細胞癌預后風險評估模型構建相關圖（a：預后相關差異基因森林圖；b：15個基因的部分似然偏差圖和系數；c：15個基因mRNA表達熱圖）

2.2 PIRS對肝細胞癌患者預后的評估及驗證 在TCGA數據庫中，高風險組患者預后較差，其中位OS明顯低于低風險組（P＜0.01，圖2a，見插頁）。隨著PIRS升高，肝細胞癌患者OS明顯縮短（圖2b，見插頁），PIRS的中位值可以將患者分為高、低風險兩組（圖2c，見插頁）。通過隨時間變化的ROC曲線，PIRS的 AUC 值在 1、2、3年分別為 0.871、0.846和 0.831（圖2d，見插頁）。

同時，經外部ICGC數據庫驗證，相比低風險組，高風險組患者預后較差（P＜0.01，圖2e，見插頁）。PIRS與OS生存狀態的動態分布圖和PCA結果如圖2f、g所示，在驗證數據庫中得到一致的結果。AUC值在1、2、3年時分別為 0.844、0.733和 0.751（圖 2h，見插頁），證明PIRS對預測肝細胞癌患者的預后具有較高的準確性。

圖2 PIRS對肝細胞癌患者預后的評估及驗證（a、e：PIRS與預后的關系；b、f：PIRS與總生存期散點圖；c、g：主成分分析分布圖；d、h：ROC 曲線圖）

2.3 PIRS與臨床病理指標預測患者預后的有效性比較 臨床病理指標在患者預后的評估上有指導意義，但現有的指標不足以滿足臨床個體化治療的需求，需進一步完善預后評估體系。在TCGA數據庫中，通過單因素Cox回歸分析，腫瘤的病理分期和PIRS與預后相關（P＜0.05）；多因素回歸分析顯示，PIRS是患者預后的獨立預測指標（HR=2.802，95%CI：2.286～3.433，P＜0.01，圖 3a）；病理分期處于晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者的PIRS較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高（圖3b）。根據AUC結果提示，相比現有的臨床病理指標，PIRS對預后預測的有效性更高（AUC=0.870＞0.643，圖 3c）。

通過ICGC數據庫進行驗證，單因素Cox回歸顯示，患者性別、腫瘤病理分期和PIRS與預后有關（P＜0.05）；多因素回歸分析顯示，PIRS為患者預后的獨立預測指標（HR=1.873，95%CI：1.427～2.460，P＜0.01，圖3d）。病理分期處于晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者的PIRS較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高（圖3e）。相比臨床病理指標，PIRS對預后預測有更高的有效性（AUC=0.844＞0.767，圖3f）。說明PIRS預測肝細胞癌患者預后的有效性不亞于現有的臨床病理指標，具有臨床價值。

圖3 肝細胞癌預后風險評估模型的獨立預后分析（a、d：單因素與多因素Cox回歸分析結果圖；b、e：PIRS與病理分期關系；c、f：PIRS與臨床指標ROC曲線圖）

2.4 PIRS評估TME免疫浸潤狀態 在TCGA數據庫中，高風險組的B細胞、CD8+T細胞和自然殺傷（NK）細胞含量均明顯低于低風險組（均P＜0.01），但高風險組中巨噬細胞含量高于低風險組（P＜0.01）；上述結果在ICGC數據庫中均得到驗證（圖4a、b）。同時，通過TIDE對TCGA數據庫的mRNA數據進行計算，高風險組中T細胞驅逐（exclusion）評分和免疫功能障礙相關的TIDE預測評分相比低風險組均明顯升高（均 P＜0.01，圖 4c、d）。綜上，高風險組的 TME處于“冷腫瘤”狀態，是肝細胞癌患者免疫系統被抑制的重要因素。

高風險組患者發生的免疫抑制可能與T細胞的細胞毒性減弱以及干擾素反應性減低有關。在TCGA數據庫中，高風險組細胞毒性通路、免疫促進通路、T細胞共刺激通路以及Ⅱ型干擾素反應通路的活性均低于低風險組（均P＜0.01，圖4e）。在ICGC數據庫中，高風險組的Ⅰ型干擾素反應通路活性較低風險組低（P＜0.05，圖4f）。通過對TCGA免疫景觀圖譜的分析，發現創傷愈合型（C1）的PIRS最高，分別與IFN-γ為主型（C2）、炎癥反應型（C3）及淋巴細胞耗竭型（C4）比較差異均有統計學意義（均P＜0.01，圖4g）。C1與血管生成基因的高表達相關，促進腫瘤的增殖[11]。上述研究結果均提示高風險組預后差可能與腫瘤細胞的免疫逃逸有關。

圖4 基于肝細胞癌預后風險評估模型的腫瘤免疫微環境評估（a、b：PIRS與免疫浸潤細胞含量關系；c：PIRS與T細胞驅逐評分關系；d：PIRS與腫瘤免疫功能障礙與逃逸預測評分關系；e、f：PIRS與免疫相關通路關系；g：PIRS與TCGA免疫景觀圖譜關系）

2.5 PIRS相關通路以及生物學功能 在TCGA數據庫中，通過KEGG富集分析，細胞周期、堿基切除修復、同源重組、錯配修復、p53信號通路及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）信號通路富集在高風險組，與腫瘤細胞增殖及血管新生有關。除此之外，高風險組中富集了TGF-β信號通路，其能調控腫瘤免疫逃逸過程，進一步促進腫瘤的發生、發展（圖5a）。低風險組主要富集了與代謝有關的一系列通路，其中包括脂肪酸代謝、初級膽汁酸生物合成代謝、視黃醇代謝以及色氨酸代謝等，低風險組主要與維持機體自身的生理活動有關（圖5b）。

通過GO富集分析，高風險組富集了細胞周期相關的生物學活動，此外，發現PIRS與大分子的甲基化相關（圖5c）。低風險組則與脂肪酸代謝以及蛋白質激活級聯反應等生物學活動密切相關（圖5d）。

圖5 PIRS相關通路生物學功能與通路富集分析結果（a：高風險組KEGG通路富集圖；b：低風險組KEGG通路富集圖；c：高風險組GO功能富集圖；d：低風險組GO功能富集圖）

3 討論

細胞焦亡的概念最早可追溯至1992年，研究發現小鼠巨噬細胞感染志賀氏菌可導致細胞死亡[12]。隨后發現細菌感染引起的巨噬細胞死亡是一種完全不同于凋亡的細胞死亡方式[13]。隨著半胱氨酸天冬氨酸酶-1（caspase-1）以及gasdermin蛋白家族的發現，細胞焦亡的機制被逐漸闡明。細胞焦亡信號通路分為依賴caspase-1的經典途徑和依賴caspase-4/5/11的非經典途徑。gasdermin-N結構域的質膜成孔活性是引起細胞焦亡的必要條件[14]，其可通過誘導質膜孔的形成，釋放IL-1β和IL-18，導致細胞膜破裂從而發生焦亡[15]。2018年，細胞死亡命名委員會將pyroptosis定義為一種調節性細胞死亡[2]，嚴重依賴于gasdermin蛋白家族成員的質膜孔形成，通常（但并不總是）由于caspase的激活所導致。

在15個基因中有4個基因編碼的蛋白直接參與細胞焦亡的炎癥級聯反應，包括GZMA、NLRP6、GSDMC以及NOD2。NK細胞和CD8+T細胞通過GZMA誘導細胞焦亡的方式來殺傷GSDMB陽性的腫瘤細胞，起到抗腫瘤作用[16]。同時，IFN-γ能上調GSDMB表達并促進腫瘤細胞發生凋亡[16]。此外，炎癥小體已被證明可通過介導炎癥反應參與細胞焦亡。NLRP6是炎癥小體的組成部分，可介導中性粒細胞炎癥反應[17]。但有研究發現，在NLRP6基因敲除的小鼠肺中，NK細胞介導的IFN-γ水平升高，且NLRP6可抑制革蘭陽性球菌感染所致的肺內中性粒細胞招募[18]。NLRP6通過激活caspase-1誘導牙齦成纖維細胞發生焦亡以及加重氧/糖剝離再灌注模型的神經元損傷[19-20]。上述研究結果均提示NLRP6參與炎癥反應的調控，但具體調節機制有待進一步明確。GSDMC是gasdermin蛋白家族中的一員，同樣具有誘導質膜孔形成的能力。在低氧條件下，磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3與程序性死亡受體-配體1（PD-L1）相互作用增強GSDMC基因轉錄，GSDMC的高表達與預后不良有關[21]。GSDMC/caspase-8介導癌細胞中的非經典的焦亡途徑[21]。此外，NOD2除了可以促進細胞凋亡和加重炎癥反應，還能誘導細胞焦亡[22]。

此外，有5個受體蛋白的編碼基因和1個配體的編碼基因，都參與腫瘤微環境中的免疫調節，分別是IL-7R、IL-18RAP、IL-15RA、CCR7、CSF3R 以及 CCL20。IL-7R編碼一種具有特異性α鏈和共細胞因子受體γ鏈的異二聚體受體。在乳腺癌、肺癌、腎癌和結腸癌組織中，IL-7R和（或）IL-7的表達增加[23]，促進肝細胞癌細胞的增殖和轉移[24]。IL-18RAP通過IL-18和IL-18RAP軸在炎癥和免疫調節中發揮作用[25]。IL-15和IL-15RA作為共刺激因子可提高TME內NK細胞和CD8+T細胞的浸潤水平，在膠質瘤治療中能提高溶瘤病毒治療聯合免疫治療的協同效應，提高抗腫瘤作用[26]。除此之外，TGF-β可下調 NK細胞活化標志物和細胞毒性顆粒的表達，研究發現IL-15和IL-15RA是TGF-β信號通路的抑制劑[27]。在抑制性腫瘤微環境中，IL-15和IL-15RA有潛力成為重新激活NK細胞的靶點，從而逆轉NK細胞的功能障礙。CCR7主要在未發生細胞焦亡的樹突狀細胞（dendritic cells,DC）中發揮作用，過度活躍的DC依賴于CCR7，提高自身遷移到淋巴結引流區的能力和T淋巴細胞的細胞毒性[28]。CSF3R基因缺失突變導致先天性中性粒細胞減少癥，粒細胞巨噬細胞刺激因子刺激機體生成粒細胞，調節免疫[29]。CCL20是趨化因子受體CCR6的配體，首先在肝臟中被檢測到并且表達在巨噬細胞中，其能激活輔助性T細胞17產生IL-17。同時，IL-17也是CCL20表達的強誘導因子[30]。因此，上述正反饋關系表明 CCL20水平與IL-17信號激活密切相關，參與機體的固有免疫。

參與模型構建的另外5個基因同樣與TME息息相關，參與腫瘤的惡性生物學行為。MEP1A編碼是一種鋅金屬內肽酶，有蛋白酶活性，通過調節上皮間質轉化參與肝癌的疾病進展[31]。HPN編碼絲氨酸蛋白酶，主要在肝臟中表達，也與前列腺癌和卵巢癌的發生、發展有關[32]。PSEN1編碼的蛋白是組成膜蛋白γ分泌酶的成分，研究發現PSEN1可通過抑制應激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶途徑從而抑制機體免疫激活信號的傳導[33]。RHOG是控制癌細胞惡性生物學行為的信號元件，影響內皮細胞的遷移和細胞間的黏附，介導膠質母細胞瘤細胞的侵襲[34]。ITGA5是整合素家族成員，mir-26a通過ITGA5誘導肝癌細胞失去歸巢能力而發生凋亡[35]。

肝臟是一個沉默的器官，肝癌一旦發現大多數已是晚期，其惡性程度高，嚴重威脅著國人的身體健康[1]。肝細胞癌預后風險評估模型的高風險組患者TME表現出的免疫抑制狀態，可能與T細胞的細胞毒性減弱以及干擾素反應性減低有關。研究表明病毒侵襲引發Ⅰ型干擾素的產生影響細胞中脂肪酸代謝，促進胞內ATP含量升高，使細胞產生抗病毒效應[36]。因此，高風險組的干擾素反應性減低，可能更容易患HBV、HCV等病毒感染，進一步引起肝硬化以及肝癌的發生。同時，高風險組中富集的TGF-β通路可通過T細胞驅逐降低對PD-L1檢查點抑制劑的療效[37]，促進腫瘤免疫逃逸，對患者預后造成不利影響。

免疫治療是基于腫瘤細胞的免疫逃逸機制而設計，如靶向血管新生，激活效應免疫細胞，抑制巨噬細胞和調節性T細胞釋放TGF-β等。值得關注的是，信迪利單抗聯合貝伐珠單抗已經獲批用于肝細胞癌一線治療[38]。生物制劑的出現為腫瘤治療提供更多的可能性，研究人員發現在黑色素瘤的免疫治療過程中，一部分患者對免疫治療有先天抵抗作用。加入細胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑可以提高腫瘤對免疫治療的敏感性，同時抑制腫瘤細胞的生長[39]。本研究結果發現細胞周期通路在高風險組顯著富集。由于目前肝細胞癌單用免疫治療的療效不理想，或許聯合細胞周期抑制劑能提高肝細胞癌患者對免疫治療的敏感性。

綜上所述，聯合用藥為肝細胞癌的精準治療提供可能，而細胞焦亡和炎癥反應相關通路將成為其中一個重要的靶點，值得深入研究。