miR-216a對人外周血單個核細胞衍生的巨噬細胞特性的影響

韓 爽，陳 宇，張偉麗

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 阜外醫院 心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037)

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發生和發展的重要病理基礎。循環血中的單核細胞遷移并黏附于活化的血管內皮細胞，浸潤至內膜下層形成巨噬細胞是動脈粥樣硬化的起始環節，單核-巨噬細胞通過極化和分泌炎性因子等機制調控動脈粥樣硬化發展的各個階段。巨噬細胞在不同微環境下具有表型異質性和可塑性，主要分為兩種類型：經典活化型巨噬細胞(classical activated macrophages, M1)、替代活化型巨噬細胞(alternatively activated macrophages, M2)[1]。M1型巨噬細胞在斑塊中大量存在，通過分泌炎性因子促進動脈粥樣硬化進展；反之，M2型巨噬細胞可以通過分泌抗炎因子發揮抑制斑塊進展的作用[2]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA，在調控單核-巨噬細胞功能中的作用受到廣泛關注[3]。已有研究報道miR-216a可以激活端粒酶，促進人單核細胞系THP-1細胞衍生的巨噬細胞向M1型極化[4]，但miR-216a對人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)衍生的巨噬細胞特性尚不清楚。人PBMCs為原代培養單核細胞，能更真實地反映體內細胞狀態，是研究動脈粥樣硬化的適宜模型[5]。本研究旨在探討miR-216a對PBMCs衍生的巨噬細胞炎性反應和極化分型的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養基、佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和Histopaque?1077淋巴細胞分離液(Sigma公司)，干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和白介素-4(interleukin-4, IL-4)(PeproTech公司)，PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser反轉錄試劑盒(Takara公司)，Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen公司)，Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)，抗體CD86和CD206(BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人PBMCs的分離和培養：研究對象來自中國醫學科學院阜外醫院疑為冠心病行冠狀動脈造影檢查的患者6例，外周血標本來自于晨起空腹抽血。中國醫學科學院阜外醫院倫理委員會批準了本研究設計以及人外周血的使用，所有患者均簽署書面知情同意書。

采用密度梯度離心法分離人PBMCs：肝素抗凝的新鮮外周血4 mL，1 500 r/min室溫離心10 min，棄上層血清，加入磷酸緩沖液稀釋至終體積4 mL，充分混勻后，沿管壁緩慢加入4 mL Histopaque?1077淋巴細胞分離液。隨后1 500 r/min室溫離心40 min，取中間層霧狀液體，加入6倍體積的磷酸緩沖液稀釋，再次1 700 r/min室溫離心10 min，加入磷酸緩沖液洗滌兩次，得到人PBMCs懸液[6]。在含有20%胎牛血清和100 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子的RPMI-1640培養基中培養PBMCs，并放置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.2.2 巨噬細胞極化模型的建立：將生長狀態良好的PBMCs以(0.8～1.0)×106個/mL的濃度在12孔板中培養，使用100 ng/mL的PMA刺激48 h后，PBMCs分化成M0型初始巨噬細胞。繼而，用1 ng/mL的LPS和20 ng/mL的IFN-γ刺激48 h，誘導M0型初始巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化；用20 ng/mL的IL-4刺激48 h，誘導M0型初始巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化。

1.2.3 細胞轉染：使用lipofectamine 3000試劑將miR-216a模擬物(mimics)和陰性對照(negative control，NC)以終濃度為50 nmol/L轉染入巨噬細胞，培養48 h。細胞轉染步驟參考Lipofectamine 3000試劑說明書。miR-216a mimics序列如下：正義鏈5′-UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-3′;反義鏈5′-AC AGUUGCCAGCUGAGAUUAUU-3′。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測基因表達水平：使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒提取細胞總RNA，并反轉錄合成cDNA，然后使用SYBR Green qPCR Mix試劑配制反應體系，利用ABI ViiA7 System實時熒光定量PCR儀檢測基因的mRNA表達水平。擴增程序如下：95 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共40個循環。結果使用2-ΔΔCt定量法進行分析，以GAPDH為內參照。基因引物序列見表1。

表1 實時熒光定量 PCR 引物序列

1.2.5 流式細胞術：收集M1和M2型巨噬細胞，分別向細胞內加入抗體CD86和CD206，4 ℃避光孵育30 min。用磷酸緩沖液洗滌細胞，并重新懸浮，使用Accuri C6 流式細胞儀(BD公司)進行檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PBMCs衍生的巨噬細胞極化模型建立

流式細胞儀檢測結果顯示，LPS和IFN-γ共同誘導的M1型巨噬細胞中，M1型表面標志物CD86陽性率達89.9%(圖1A)；IL-4誘導的M2型巨噬細胞中，M2型表面標志物CD206陽性率達92.1%(圖1B)。

A.the expression of CD86 in M1 macrophages; B.the expression of CD206 in M2 macrophages

實時熒光定量PCR結果顯示，M1型巨噬細胞特異性表面標記物CD86 mRNA的相對表達水平是M0型巨噬細胞的10.3倍(P<0.01)(圖2A)；M2型特異性表面標記物CD206 mRNA的相對表達量比M0型升高12倍(P<0.01)(圖2B)。

A.the expression of CD86; B.the expression of CD206；*P<0.01 compared with M0 macrophages

2.2 M1/M2型巨噬細胞炎性相關因子的特點

與M0型巨噬細胞相比，在誘導激活的M1型巨噬細胞中，促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對表達量分別增加10.6倍、11.5倍、9.3倍(P<0.01)(圖3A)；抗炎細胞因子TGF-β和IL-10 mRNA在M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞中的相對表達水平均較M0型顯著降低(P<0.01)(圖3B)。

A.the expressions of IL-1β, IL-6 and TNF-α; B.the expressions of TGF-β and IL-10; 0.01 compared with M0 macrophages

2.3 miR-216a對巨噬細胞表面標記物和炎性因子的影響

與對照組相比，過表達miR-216a后，M2型巨噬細胞表面標記物CD163 mRNA的相對表達水平升高0.4倍(P<0.05)，但CD206 mRNA表達水平無顯著性差異(圖4A)。此外，過表達miR-216a后，M2型巨噬細胞的促炎因子TNF-α和IL-1β mRNA的相對表達水平降低約30%(P<0.05)(圖4B)，抗炎因子TGF-β和IL-10 mRNA的相對表達水平升高約0.6倍(P<0.05)(圖4C)。

A.the expressions of CD163 and CD206; B.the expressions of TNF-α and IL-1β; C.the expressions of TGF-β and IL-10; *P<0.05 compared with negative control(NC)

3 討論

巨噬細胞通過合成和分泌細胞因子參與炎性反應、脂質蓄積以及動脈粥樣硬化斑塊穩定性的調節。巨噬細胞的異質性使其在不同組織微環境表現出不同的炎性反應特征和功能特性[7]。M1型在炎性反應早期階段通過NF-κB信號通路促進多種炎性因子和趨化因子的釋放，促進炎性反應，同時降低膽固醇蓄積導致動脈粥樣硬化斑塊不穩定甚至破裂[8]。M2型為炎性反應消退階段的主要活化表型，引起抗炎細胞因子釋放并促進組織的修復和再生[9]。M1型/M2型巨噬細胞平衡極化影響著炎性反應性疾病的進程，其中M2型巨噬細胞更具可塑性，并容易極化為炎性M1型巨噬細胞[10]。

miRNA在巨噬細胞極化中發揮重要作用。例如，miR-495通過抑制肥胖相關基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)表達促進M1型極化，加重小鼠胰島素抵抗和脂肪組織炎性反應[11]；miR-145靶向抑制靶基因IL-16，上調IL-10的表達，促進細胞向M2型極化[12]。本課題組先前的研究發現，miR-216a通過Smad3/NF-κB途徑激活端粒酶，促進THP-1衍生的巨噬細胞向M1型極化[4]。本研究結果發現，miR-216a誘導了PBMCs衍生的巨噬細胞中M2型表面標記物CD163和CD206的表達，抑制炎性因子表達，增加抑炎因子表達，從而促進M2型巨噬細胞極化，提示miR-216a在不同微環境中的作用復雜。

THP-1單核-巨噬細胞是一種具有相同表觀遺傳背景的永生單核細胞系，而人PBMCs是原代單核細胞系[5]。LPS、IFN-γ和IL-4等刺激物誘導THP-1單核-巨噬細胞的極化模型與原代單核細胞PBMCs來源的巨噬細胞極化模型，二者間存在重要差異[13]。例如，與THP-1細胞相比，PBMCs對LPS刺激的反應更強烈，主要表達單核細胞分化抗原CD14抗體[14]。因此，在相同刺激下，不同來源的巨噬細胞可能產生不同的極化表型差異。本研究的局限性在于在探究miR-216a對巨噬細胞特性的影響時，僅采用實時熒光定量PCR方法檢測細胞表面標記物。在后續的實驗中將采取流式細胞術和免疫熒光技術進一步鑒定巨噬細胞極化分型的特點。

綜上，本研究發現miR-216a可促進人PBMCs來源的巨噬細胞向M2型極化并抑制炎性因子表達，這為miR-216a對巨噬細胞極化的調節提供了新的證據。尋找影響巨噬細胞極化的調控因子可能為慢性炎性反應性疾病如動脈粥樣硬化的治療提供新思路。