胃癌患者血清IL-1的升高和癌組織JAK2/STAT3信號通路的激活

牛世偉，蘇 韞*，龔紅霞，李婷婷，曾元丁，張 晗，聶 蓬

(甘肅中醫藥大學 1.基礎醫學院；2.甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州730000；3.甘肅省武威腫瘤醫院 武威醫學科學院 胃外科，甘肅 武威 733000)

胃癌(gastric cancer)作為世界上的常見惡性腫瘤，世界衛生組織國際癌研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)最新統計數據顯示，其發病率居第五位，病死率居第四位[1]。腫瘤的十大特征中就有炎性反應[2]。胃癌的最初表現為慢性胃炎，長時間的炎性反應可導致胃黏膜出現損傷，最終成為胃癌[3]。有研究報道[4]，炎性因子可導致癌基因突變、細胞惡性轉化及介導腫瘤的免疫逃逸。炎性細胞通過分泌多種炎性因子促進腫瘤細胞生長、侵襲及轉移，同時影響腫瘤的預后。其中的IL-1和IL-10是目前研究較多的兩種炎性因子，IL-1由活化單核-巨噬細胞產生，可加速炎性反應的發生發展；而IL-10可抑制炎性因子的合成與釋放從而減輕炎性反應。JAK2/STAT3信號通路作為經典的炎性通路，在腫瘤中被廣泛激活，參與了多種腫瘤的發生及發展[5]。本實驗擬通過收集臨床患者組織和血清及健康者血清標本，探討炎性因子IL-1、IL-10和JAK2/STAT3信號通路及下游相關蛋白在胃癌發生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇在甘肅省武威腫瘤醫院2018年1月至2018年12月手術治療的胃癌患者及同期健康體檢的人群各30例，收集患者及健康體檢者的基本資料及晨起空腹靜脈血。選取患者的胃癌組織、距病灶5 cm的癌旁組織及距病灶10 cm的正常組織各30例。本研究獲得武威市腫瘤醫院醫學倫理委員會批準(倫理審批文號:WWZL-LL-2016-0001)。納入標準：1)經病理檢查診斷為胃癌的患者；2)年齡在40～60歲且預計存活周期3個月以上者；3)血常規、心、肺、肝、腎功能基本正常者。排除標準：1)身體狀態差，難以耐受手術者；2)患有嚴重心血管疾病及其他惡性腫瘤者；3)正在參加其他藥物臨床研究者。

1.1.2 試劑及試劑盒：白細胞介素1(interleukin 1,IL-1)、白細胞介素10(IL-10)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bax和Bcl-2兔抗人多克隆抗體(Immunoway公司)；DAB顯色試劑盒(中國北京中杉金橋生物技術有限公司)；Trizol(Ambion公司)；RT-qPCR試劑盒(上海翊圣生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測IL-1、IL-10的含量：分離患者及健康體檢者血清，保存于-80 ℃冰箱；采用酶聯免疫吸附實驗測定血清中IL-1和IL-10水平，實驗過程依據說明書嚴格進行，用酶標儀檢測各孔450 nm處波長的吸光度(A)值。

1.2.2 免疫組化法檢測Bax、Bcl-2蛋白含量：將組織固定于4%多聚甲醛中，常規包埋、切片、水化，常溫3% H2O2孵育，用PBS洗滌3次后，用檸檬酸鈉溶液修復抗原，分別加入Bax、Bcl-2一抗，4 ℃過夜。清洗后室溫孵育二抗，30 min后PBS清洗DAB顯色，封片后切片在光鏡下觀察并拍照。使用ImageJ軟件分析平均吸光度(A)值。

1.2.3 蛋白印跡法(Western blot)檢測組織JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax蛋白含量：提取組織蛋白，樣品煮沸5 min后變性，BCA法檢測蛋白濃度，配制12% SDS-PAGE膠，上樣電泳，SDS-PAGE分離蛋白質后將凝膠蛋白轉移至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉2 h后，孵育于相應一抗稀釋液中4 ℃搖床過夜。第二天，TBST洗膜10 min×3次后于4℃搖床二抗孵育2 h。再用TBST洗膜3次后用ECL發光試劑曝光，使用ImageJ軟件統計各蛋白條帶吸光度(A)值，與內參吸光度(A)值的比值即為相對蛋白表達量。

1.2.4 RT-qPCR定量檢測各組織中JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax mRNA的含量：引物序列(表1)。取凍存組織100 mg，按Trizol法提取RNA，分光光度計測定其A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0，采用SYBR法以cDNA為模板在實時熒光定量PCR進行檢測，反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。繪制熔解曲線，根據比較Ct值法分析各基因的相對表達量，相對表達量為2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 健康人與胃癌患者基線信息比較

健康人30名，其中男性14名，女性16名，平均年齡為(52.2±8.2)歲；胃癌患者30例，其中男性17例，女性13例，平均年齡為(55.5±6.3)歲，兩組性別及年齡差異無統計學意義。

2.2 各組血清中IL-1、IL-10含量水平比較

與對照組相比，胃癌患者血清中IL-1含量升高，而IL-10含量下降(P<0.05)(表2)。

表2 IL-1、IL-10在各組血清中濃度

2.3 各組組織中Bax、Bcl-2含量水平比較

胃癌組織中Bax主要表達于細胞質，而Bcl-2表達于細胞核，圖片中棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(圖1,2)。Bax在胃癌組織中的含量明顯低于對照組和癌旁組，Bcl-2在胃癌組織中的含量明顯高于對照組和癌旁組(P<0.05)(表3)。

A.Bax content in normal tissue;B.Bax content in adjacent tissue; C.Bax content in cancer tissue

表3 Bax、Bcl-2在各組組織中的含量

2.4 各組組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax蛋白含量水平比較

與對照組相比，胃癌組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量增加，而Bax含量減少(P<0.05)。與癌旁組織比較，癌組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量增加，而Bax含量減少(P<0.05)(圖3，表4)。

表4 JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax的含量情況

A.Bcl-2 content in normal tissue; B.Bcl-2 content in adjacent tissue; C.Bcl-2 content in cancer tissue

圖3 JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax在各組組織中的含量

2.5 各組組織中JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA含量水平比較

與對照組相比，胃癌組織中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量增加，而Bax mRNA含量減少(P<0.05)。與癌旁組織比較，癌組織中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量增加，而Bax mRNA含量減少(P<0.05)(表5)。

表5 RT-qPCR檢測各組mRNA的含量

3 討論

最近幾年大量的報導指出IL-1和慢性炎性反應與腫瘤的發生發展緊密相關。胃癌細胞在自身生長的過程中，能通過多種方式刺激單核-巨噬細胞、上皮細胞等分泌大量的IL-1和IL-6[6-7]。有研究發現[8]，在大鼠胃癌模型中，IL-10能夠有效提高血清IFN-γ和IL-4的水平，降低TNF-α水平，具有一定的抗腫瘤效果。藏藥二十五味驢血丸可通過提高治療組動物血清中IL-10及降低TNF-α、IL-6、IL-17的含量水平來起到治療關節炎的作用，其機制可能與調節JAK2/STAT3信號通路有關[9]。Bax和Bcl-2為JAK2/STAT3信號通路的下游因子，兩者可形成一個凋亡調節系統，該系統參與細胞的增殖、存活，抑制細胞的凋亡和炎性[10-11]。在本研究中，與對照組相比，胃癌組中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量均增加，而Bax含量減少，胃癌組中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量均增加，而Bax mRNA含量減少，血清中IL-1含量增高，而IL-10含量下降，與相關文獻報道一致。

綜上所述，由IL-1引發的炎性反應在胃癌的發展過程中發揮了重要的作用，同時JAK2/STAT3信號通路被激活進而調控下游的Bax和Bcl-2參與胃癌異常的凋亡與增殖，通過干預胃癌前炎性反應以及開發JAK2/STAT3信號通路抑制劑可能為臨床防治胃癌提供新思路。另外，IL-1、IL-10炎性細胞因子與JAK2/STAT3信號通路之間的靶向因果關系尚須在動物實驗及細胞實驗上進一步驗證。