酮咯酸氨丁三醇抑制膝骨關節炎模型大鼠炎性反應

李 蓉，朱含月

(無錫市第二人民醫院 藥劑科,江蘇 無錫 214002)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)多發生于中老年人群，以膝蓋紅腫、疼痛、活動受限、關節軟骨退變、滑膜炎性反應等為主要病理癥狀的疾病[1]。KOA可導致患者關節畸形甚至殘廢，嚴重影響中老年人生活質量及生命健康[2]。目前研究發現Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路參與KOA滑膜炎性反應及纖維組織增生過程[3]。酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine，KT)為非甾體類抗炎藥[4]，對創傷性疼痛、術后疼痛、腫痛、劇烈痛等各種疼痛有較好的治療效果[5]。但KT對KOA過程中滑膜炎性反應及疼痛的影響，未見報道。本研究建立KOA大鼠模型，對此進行探究，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 動物：清潔級雄性SD大鼠60只，體質量200～220 g[無錫市第二人民醫院動物中心提供批號為IACUC-01(20160917)]。本研究經無錫市第二人民醫院動物倫理委員會批準同意。

1.1.2 主要試劑：KT注射液(上海恒斐生物科技有限公司，純度：≥99.9%)；柳氮磺胺吡啶(上海彩佑實業有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(Pierce公司)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin staining，HE)染色試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(上海篤瑪生物科技有限公司)；白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司)；TLR4抗體、NF-κB p65抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、神經突蛋白(neuritin)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、N-鈣黏素(N-cadherin)、整合素金屬蛋白酶4(integrin metalloproteinase 4,ADAM4)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：參照文獻[6]，于右膝關節內側取長約2 cm的縱切口，用改良Hulth法建立大鼠KOA模型，術后1周，若出現膝關節紅腫、步態不協調、跳躍現象，表明造模成功，將建模成功的大鼠用隨機數字表法，分為模型組、KT低(1 mg/kg)、高(4 mg/kg)劑量組、TAK-242 組(TLR4拮抗劑，1 mg/kg)，每組10只；另取10只大鼠，只暴露膝關節，作為對照組。造模成功后(術后第8 d)開始給藥，KT參照文獻[7]設置劑量，并用0.9%氯化鈉溶液配制為0.10、0.40 mg/mL的混懸液，以10 mL/kg的體積經右膝關節肌肉處注射給藥1次/d，TAK-242組參照文獻[8]設置劑量，并經尾靜脈注射給藥2次/周；對照組與模型組肌肉注射給予等量0.9%氯化鈉溶液1次/d，各組連續給藥2周。

1.2.2 大鼠膝關節腫脹程度觀察及自發疼痛行為步態評分的檢測：末次給藥12 h后，觀察大鼠膝關節紅腫、腫脹程度，參照文獻[9]將大鼠置于17 cm/s的電動跑步機上行走20 s，觀察大鼠步態行為，并進行評分，總分以4分計，得分越高其疼痛行為越嚴重。

1.2.3 大鼠熱刺激撤足痛閾值的檢測：行為步態評分后，參照文獻[9]利用鼠爪熱輻射刺激測痛儀檢測大鼠后肢足跟部皮膚對熱刺激的反應，記錄大鼠鼠爪撤足的反應時間，即熱痛閾(heat-pain threshold,hppt)。

1.2.4 HE及馬森(Masson)染色觀察大鼠滑膜組織形態及組織纖維增生情況：麻醉處死大鼠，剝離完整滑膜組織(髕骨以下一層平滑光亮且呈淺淡黃色的組織)，剪取0.5 g滑膜組織，于液氮中保存備用，剩余組織立即放入4%多聚甲醛中固定24 h后，進行常規透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)。取部分切片，按HE及馬森染色試劑盒說明書行染色、封片后，置于顯微鏡下觀察組織染色情況。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠滑膜組織neuritin蛋白表達：取1.2.4中剩余切片，常規處理后，加入一抗抗體(neuritin、1∶500)4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液(1∶1 000)，室溫孵育30 min，用DAB顯色、蘇木精復染、封片后。于400倍光鏡下拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統以5個視野陽性表達的平均吸光度值[absorbance(A)value]表示neuritin蛋白表達水平。

1.2.6 ELISA檢測大鼠滑膜組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平：取1.2.4中液氮中保存的滑膜組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿、分離后取上清液，按ELISA試劑盒說明書方法檢測IL-1β和TNF-α水平。

1.2.7 Western blot檢測TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4蛋白表達 取組織上清液，用蛋白提取試劑盒軸提蛋白后，BCA法測蛋白濃度，取30 μg蛋白行電泳、轉膜反應，加入抗體[TLR4、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4(1∶100)，β-actin(內參)1∶2 000]4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色，以化學發光成像儀觀察條帶并拍照，Image-J軟件分析蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 KT對大鼠膝關節腫脹程度、自發疼痛行為步態評分及熱刺激撤足痛閾值的影響

對照組大鼠膝關節及活動步態行為正常；與對照組相比，模型組大鼠膝關節紅腫，活動較少，行走步態不協調，自發疼痛行為步態評分升高，熱刺激撤足痛閾值降低(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組關節紅腫、行走步態不協調行為緩解，自發疼痛行為步態評分降低，熱刺激撤足痛閾值升高(P<0.05)(表1)。

表1 自發疼痛行為步態評分及熱刺激撤足痛閾值比較

2.2 KT對大鼠滑膜組織病理形態的影響

對照組大鼠滑膜組織正常，未見明顯炎性損傷。模型組大鼠HE染色可見滑膜組織充血腫脹、肥厚粗糙，滑膜細胞增生呈多層且排列不整齊，毛細血管豐富及炎性細胞浸潤明顯；馬森染色可見纖維組織增生嚴重。與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織肥厚、炎性細胞浸潤及纖維組織增生等病理現象均不同程度減輕。其中KT高劑量組優于低劑量組，KT高劑量組與TAK-242 組病理損傷相近(圖1)。

圖1 大鼠滑膜組織病理損傷

2.3 KT對大鼠滑膜組織中neuritin蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠滑膜組織neuritin蛋白表達增高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜Neuritin蛋白表達降低(P<0.05)(圖2，表2)。

圖2 大鼠滑膜組織免疫組化圖

表2 各組大鼠Neuritin蛋白表達結果比較

2.4 KT對大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平的影響

對照組相比，KOA組大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)；與KOA組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)(表3)。

表3 大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平比較

2.5 KT對大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達的影響

對照組相比，模型組大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.05)(圖3，表4)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表4 大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平

2.6 KT對大鼠OPN、ADAM4蛋白表達的影響

對照組相比，模型組大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達降低(P<0.05)(圖4，表5)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表5 大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達水平

3 討論

KOA過程中，滑膜細胞及滑膜成纖維細胞活化，可分泌炎性細胞因子，如IL-1β、TNF-α等，來進一步促進滑膜炎性反應，引起關節結構損傷[10]。神經營養因子neuritin可間接反映疼痛程度，并參與KOA疼痛過程[11]。本研究發現，模型大鼠關節腫脹、活動受限、滑膜組織炎性細胞浸潤及纖維組織增生等KOA病理癥狀嚴重，并伴隨著自發疼痛行為步態評分升高、熱痛閾值降低、滑膜組織IL-1β、TNF-α水平及疼痛相關指標neuritin表達升高，提示大鼠KOA造模成功。

KT是一種非甾體類抗炎藥物，可用于各種疼痛的治療[4]，但KT卻在KOA中應用較少。本研究發現，KT劑量越高，大鼠KOA病理癥狀緩解越明顯，滑膜組織炎性指標及疼痛相關指標表達降低越明顯，這與報道，肌肉注射KT藥物，可緩解關節置換術患者術后疼痛及炎性應激狀態相一致[12]，提示KT也可用于KOA炎性反應及疼痛癥狀的緩解治療。

TLR4/NF-κB通路是主要的炎性調控通路[13]，也是參與KOA滑膜炎性反應、滑膜細胞及滑膜成纖維細胞增生病變的關鍵通路。NF-κB通路激活可介導OPN表達，促進滑膜成纖維細胞炎性反應及增殖，可能是關節炎患者滑膜炎性增生及病變的關鍵原因[14]。NF-κB及炎性因子可觸發TLR4炎性反應激活，并調控IL-1β炎性因子及ADAM4表達來促進滑膜增生及侵襲[15]。本研究發現，模型組大鼠滑膜組織TLR4/NF-κB通路及相關蛋白OPN及ADAM4蛋白表達均異常增高，用TAK-242 阻斷TLR4/NF-κB通路激活后，大鼠KOA疼痛及滑膜炎性損傷緩解明顯。而KT劑量越高，TLR4/NF-κB通路抑制效果越顯著，且KT高劑量組對TLR4/NF-κB通路及KOA癥狀的抑制效果，與TAK-242組相近，提示KT藥物緩解KOA大鼠滑膜炎性反應及疼痛癥狀，可能與阻斷TLR4/NF-κB通路激活有關。

綜上所述，KT可緩解KOA大鼠滑膜炎性反應及疼痛癥狀，且其緩解作用可能與阻斷TLR4/NF-κB通路激活有關。這為KT在KOA領域的應用提供一定參考。但KOA病理過程較為復雜，還涉及免疫、自噬、氧化應激等多種生理反應，KT改善KOA癥狀的其他機制，有待繼續研究。