SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的制備及樣本混檢性能分析

釗倩倩，劉雙雙，周云英，史桂芝，汪運山*

(1.山東大學附屬濟南市中心醫院 醫學實驗診斷中心，山東 濟南 250013；2.山東英盛生物技術有限公司 研發中心，山東 濟南 250100)

新型冠狀病毒(novel corona virus, severe acute respiratory syndrom corona virus 2,SARS-CoV-2)，屬于冠狀病毒科β屬[1]，跨物種傳播引起2019冠狀病毒疾病(corona virus disease 2019, COVID-19)[2-3]，對全球的公共衛生安全造成極大威脅。病毒核酸陽性被作為SARS-CoV-2感染的確診依據之一[4]，而熒光RT-qPCR依其成本低、操作流程簡單、易批量化等優點成為核酸檢測的主流技術[5]。目前為了應對大規模人群SARS-CoV-2核酸篩查，提高檢測效率，國務院及國家衛生健康委員會分別頒布了關于多樣本混合檢測的工作手冊及技術規范，分單采混檢和混采單檢兩種方式。由于混檢會降低病毒濃度，對試劑靈敏度要求更高。市售核酸檢測試劑盒性能良莠不齊，一直存在“假陰性”質疑，對混檢樣本的檢測效果未見報道。本研究擬優化熒光RT-qPCR體系中不同靶基因擴增效率，開發適用于大規模人群篩查的核酸檢測試劑盒，并考察臨床多樣本混合檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物和探針：ORF1ab和N靶基因擴增引物及探針序列源自中國疾病預防控制中心(Chinese Center For Disease Control And Prevention, CCDC)，RNaseP(ribonuclease P)作為內標基因(表1)。引物配制成濃度為20 μmol/L的溶液，探針配制濃度為10 μmol/L的溶液。

表1 SARS-CoV-2 RT-qPCR引物及探針序列

1.1.2 臨床樣本：新型冠狀病毒樣本及常見呼吸道病毒樣本均為鼻咽拭子，來自濟南市中心醫院及當地疾控部門。其中陽性樣本為臨床確診病例并經國家藥監局批準的試劑盒檢測為核酸陽性。樣本采集后放入3 mL病毒保存液中，并-70 ℃保存備用。樣本的收集及使用均獲得醫院倫理委員會批準(批準號：2020-053-01)。

1.1.3 試劑：反轉錄酶、Taq酶及PCR反應MIX(南京諾維贊生物科技有限公司)；RNA磁珠法提取試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)；參比試劑盒：Kit-B(上海伯杰醫療科技有限公司)、Kit-S(碩世生物科技股份有限公司)及Kit-Z(北京卓誠惠生生物科技股份有限公司)均為市售主流產品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取與處理：磁珠法提取鼻咽拭子樣本的病毒RNA，提取步驟及樣本用量參照試劑盒說明書。RNA提取后-70 ℃保存備用。

1.2.2 試劑盒引物及探針濃度優化：單靶基因引物濃度優化：采用單一變量原則分別優化每一個靶基因引物濃度。25 μL的擴增體系中，緩沖液、反轉錄酶及擴增酶使用量按照說明書添加，加入5 μL含靶基因的重組質粒(1 copy/μL)作為模板(本實驗室構建)，加入200 nmol/L探針，分別加入240～800 nmol/L的等量正向及反向擴增引物。

引物濃度配比優化：按照3因素四水平設計正交實驗優3個靶基因的引物濃度配比。分析每組擴增曲線的Ct值。

探針濃度優化：在25 μL反應體系中，分別加入200、320及400 nmol/L 3種濃度的探針，觀察熒光PCR擴增曲線和Ct值。

1.2.3 試劑盒擴增參數：ABI7500熒光定量PCR儀按照如下程序進行擴增：反轉錄：50 ℃ 15 min；預變性：95 ℃ 5 min；變性、退火、延伸：[95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s(檢測熒光)]×40循環。ORF1ab、N及RNaseP3個靶基因的檢測通道分別為FAM、VIC及ROX。

1.2.4 試劑盒性能分析：準確性驗證：提取107例新型冠狀病毒陰性標本(其中男性55例，女性52例，年齡4～90歲，具有發熱癥狀者28例，僅咳嗽或其他呼吸道癥狀者79例)及12例SARS-CoV-2陽性標本的病毒RNA,以獲得國藥監局批準的試劑盒作為參比試劑盒檢測SARS-CoV-2核酸，計算陽性、陰性及總符合率。

特異性驗證：檢測10種常見的呼吸道病原體陽性且經市售試劑盒檢測新型冠狀病毒核酸為陰性的鼻咽拭子樣本，分析檢測結果是否為陰性。

靈敏度分析：梯度稀釋已知濃度的陽性參考品，每個濃度重復測定20次，以ORF1ab和N同時檢出作為陽性判定標準，統計各濃度樣本檢出的陽性個數。以95%陽性檢出率的濃度值作為試劑盒的檢出限，即靈敏度。

1.2.5 臨床多樣本混合檢測效果分析：陽性樣本與陰性樣本按1/5、1/10、1/20、1/40及1/80比例混合[陽/(陽+陰)]，磁珠法提取病毒RNA。以靈敏度與本試劑盒相同的3種市售試劑盒Kit-B、Kit-S及Kit-Z作為參比，檢測SARS-CoV-2核酸，每種濃度重復檢測3次。分析全部檢出陽性結果的最高混檢比例及擴增Ct值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 試劑盒的多靶標引物濃度優化結果

單一變量優化得到每個靶基因的引物濃度范圍均為320～800 nmol/L。正交實驗中，ORF1ab、N的Ct值隨引物濃度增加而降低，RNaseP的Ct值受引物濃度影響不明顯(圖1B)。3個靶基因的均值效應極差值(Mean-value effect)趨勢為ORF1ab(delta=3.00)>N(delta=1.43)>RNaseP(delta=0.33)(圖1A)，提示ORF1ab引物濃度變化對擴增結果影響最大。在保持3個靶基因擴增效率相似的基礎上，以ORF1ab擴增效率為主要因素進行優化，獲得ORF1ab、N及RNaseP的引物濃度配比為640、800及400 nmol/L(圖1C)。

ORF1ab和N的熒光信號強度隨探針濃度的提高而增強(圖1D)，當探針濃度≥320 nmol/L時，熒光強度不再有明顯的變化；而RNaseP的熒光信號強度變化不大。因此ORF1ab、N和RNaseP探針濃度分別為320、320及200 nmol/L。

A.mean-value effect of different target genes; B.amplification Ct value of RT-qPCR under different primers concentration; C.experiment groups of different primers concentration; D.amplification curve of RT-qPCR with different probes concentration; delta Rn*.changes in fluorescence from the previous cycle

2.2 試劑盒的準確性及特異性驗證結果

準確性：本試劑盒(命名為Kit-Y)對12例陽性標本檢測結果全部為陽性，對107例陰性標本的檢測結果全部為陰性，陽性、陰性及總符合率均為100%(表2)。

表2 試劑盒Y準確性驗證結果

特異性：Kit-Y對甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、EB病毒、巨細胞病毒共10種病原菌的陽性標本的檢測結果均為陰性(NoCt)，分析特異性為100%(表3)。

表3 試劑盒Y特異性驗證結果

靈敏度：陽性定值參考品按梯度稀釋為1×105、1×104、1×103和1×102copies/mL，每個濃度重復測定20次的陽性檢出結果如表4。模板濃度為1×103copies/mL時，20個陽性樣本檢出19個，陽性檢出率為95%，符合靈敏度定義，因此Kit-Y檢測靈敏度為1×103copies/mL。

表4 試劑盒Y靈敏度分析結果

2.3 臨床多樣本混合檢測結果

多樣本混合檢測Kit-Y對ORF1ab的檢出限低于市售試劑盒(圖2)。當混合比超過1/10時，3個參比試劑盒均無法檢測到ORF1ab，而Kit-Y對其檢出限可低至混合比例1/20(P<0.01)(圖2A)；Kit-Y對N基因的檢出限與Kit-B及Kit-S相比差異無統計學意義(1/10)，但低于Kit-Z(P<0.01)；兩個靶基因的擴增Ct值均隨模板濃度降低而增大，相同模板濃度時，Kit-Y對ORF1ab的擴增Ct值低于3種參比試劑盒(P<0.05)(圖2B)，Kit-Y與Kit-S對N基擴增Ct值在不混合樣本模板濃度下分別為31.74及35.5，差異顯著(P<0.05)，Kit-Y與其余兩個試劑盒的Ct值的差異無統計學意義。

A.template dilution range of different target genes; B.amplification Ct values with same template concentration; *P<0.01，**P<0.05 compared with Kit-Y group

3 討論

以熒光RT-qPCR技術為基礎的新冠病毒核酸檢測試劑在臨床使用中多次出現假陰性的結果，甚至是個別病例還出現在不同時間5次以上結果陰性后又轉陽的現象[6]。這種現象的出現具有多方面的原因：標本的采集部位或手法不當造成病毒采集量不足；標本保存及運輸過程不當造成病毒降解等，而試劑的檢測性能尤其是靈敏度不足則是造成假陰性結果的主要實驗室原因。在本文中，3個靶基因擴增效率分析結果表明ORF1ab的擴增效率受引物濃度影響最大。以熒光PT-PCR技術為基礎的核酸檢測中，ORF1ab是檢測結果判為陽性的必要條件，其檢測靈敏度的提高，對于降低檢測結果的假陰性具有重要意義。

由于多樣本混檢只進行初步篩查，任意一個靶標檢測出陽性就需要對本組樣本單個復檢，因此單靶標的高靈敏度在樣本混合檢測過程中會更具有優勢。用9～10個樣本一組混檢的方式對292組混合樣本，通過單靶標(E)的篩查出的兩組陽性樣本，均得到了雙靶標(E/ORF1ab)的復檢及測序驗證[7]。Kit-Y及Kit-Z均具有一個高靈敏靶標，在樣本混合檢測過程中會更具有優勢。

有效的多樣本混合檢測試劑盒的開發及應用對大規模人群篩查具有重要意義。目前大多數試劑盒中的引物及探針序列都來源于中國疾病預防控制中心(CDC)或世界衛生組織(WHO)的公布數據[8-9]，本文研究發現使用相同引物來源的檢測試劑仍有不同的檢測性能，比如在選擇10個樣本進行混合檢測時，不同品牌的檢測試劑出現不同的檢測結果。差異原因可能是由于不同品牌試劑盒在緩沖體系成分、引物濃度、酶濃度及擴增條件等方面均存在差異而導致的。因此在實際應用中，對于檢測試劑盒的靈敏度及樣本的混合數量均需要預先進行分析確認以防止漏檢錯檢的發生。