環狀RNA在乳腺癌中作用的研究進展

何 嘯，胡為杰，呂文昌，任玉萍，吳 敏，吳毅平，張 奇

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 整形美容外科，湖北 武漢 430022)

乳腺癌(breast cancer，BC)是中國女性發病率最高的癌，并且是導致癌死亡的主要原因[1]。乳腺癌有5種基因分型，主要包括管腔上皮A型、管腔上皮B型、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)過表達型、基底樣型和正常乳腺樣型。此外，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)具有高轉移、復發等惡性特征，其免疫組織化學定義是雌激素受體、孕激素受體和HER2的表達缺失，且其中50%～75%的TNBC為基底樣型[2]。乳腺癌具有高復發性、高轉移性及耐藥性等特征，仍是當前亟待解決的難題。基于新型腫瘤分子靶點的發現與機制研究，對乳腺癌治療具有重要的意義。內源性環狀RNA(circular RNA，circRNA)為一類新型的非編碼RNA，在果蠅、小鼠、人類等多種物種中均有表達。最新研究表明，circRNA參與了乳腺癌發生、發展和轉移并干預乳腺癌治療效果。因此，本文主要綜述了近年來circRNA在乳腺癌中的作用機制和耐藥的研究進展。譯circRNA在乳腺癌中的功能與機制，將有助于實現對乳腺癌腫瘤本質的新認識，提供新穎的乳腺癌治療策略。

1 CircRNA分類和形成

CircRNA根據其組成可分為3種類型：外顯子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、內含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)和外顯子-內含子circRNA(exon-intronic circRNA，EIciRNA)[3]。CircRNA的形成是一種可變的環化剪接，根據剪接位點的不同，產生不同類型的circRNA，主要包括三種機制：外顯子跳躍、直接反向剪接和依賴RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)剪接。外顯子跳躍指的是pre-mRNA在轉錄過程中被部分折疊，導致下游外顯子的3-SD(splicing donor)與上游外顯子的5′-SA(splicing acceptor)連接，形成既包含外顯子又包含內含子的RNA套索，移除內含子后，最終形成ecircRNA。直接反向剪接則是pre-mRNA的側翼內含子互補序列通過直接堿基配對形成套索，通過去除或保留內含子可分別形成ecircRNA或EIciRNA。依賴RBP剪接是指，RBP與外顯子兩側的內含子上、下游堿基序列結合，拉進兩側內含子之間的距離，形成circRNA。

2 CircRNA主要特征

CircRNA具有多樣性、特異性、保守性和穩定性等特征。就多樣性而言，circRNA廣泛表達于多種原生生物、真菌、果蠅、植物和人類等生命體。CircRNA也存在于人體多種體液、組織和器官中。在一些特殊情況下，單個細胞中circRNA比相關的信使RNA(messenger RNA，mRNA)更為豐富。CircRNA具有特異性，即不同細胞、組織中，或者同一組織正常和病理狀態中，存在差異性的circRNA表達譜，并且會隨著細胞周期進程發生變化。例如，circRNA在幼豬腦發育過程中呈時空動態性變化[4]。CircRNA表達譜在各物種之間具有保守性，不僅在哺乳動物中是保守的，且在進化上相對較遠的果蠅間也具有保守性。CircRNA是RNA剪接的保守且非隨機產物，與ALU重復有關，并參與調控基因表達[5]。有意思的是，在豬中的大約20%與circRNA生成相關的剪切位點在老鼠和人類中也有相同的功能[6]。此外，circRNA通過5′與3′端首尾相連共價閉合形成環狀分子，在結構上缺乏易被降解的3′端poly尾。因此，circRNA在一定程度上可避免被RNA外切酶降解，并通過RNA折疊維持基因結構，使得circRNA具有較高的穩定性。

3 CircRNA調控機制

CircRNA主要通過競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)、結合RBP、調節轉錄和翻譯以及生成假基因來發揮調控作用。CeRNA功能是circRNA最經典的腫瘤學作用機制，即circRNA可通過堿基互補配對競爭性結合微小RNA(microRNA，miRNA)，對miRNA產生“海綿作用”，抑制miRNA的負性調節作用，從而提高相應mRNA的胞內濃度并調節細胞功能(圖1)。RBP是一類可以結合RNA并協助調控基因轉錄和翻譯的蛋白質，在circRNA的剪接、處理、折疊、穩定和定位中發揮重要作用。CircRNA與RBP的結合同樣參與了調控腫瘤進展。EIciRNA主要定位在細胞核中，可與U1核小RNA結合形成復合體，再與轉錄復合物啟動子Pol Ⅱ相互作用，最終促進親本基因表達[7]。一些位于細胞質的內源性circRNA具有合適的結構和翻譯長度，這表明circRNA具有一定的蛋白質編碼潛力[8]。然而關于乳腺癌中circRNA翻譯功能的研究還尚未見諸報道。CircRNA可通過反轉錄形成假基因，而假基因可調控DNA、RNA和蛋白質水平并廣泛存在于多種腫瘤中。目前關于circRNA和假基因的研究非常少，有待進一步探索。

圖1 CircRNA最主要的腫瘤學作用機制

4 CircRNA在乳腺癌(BC)中作用的相關機制

4.1 CircRNA調控乳腺癌(BC)細胞增殖

在TNBC中，circRNA可以通過多種方式調節癌細胞增殖。Circ-TFCP2L1在TNBC中顯著上調，導致TNBC患者的無病生存時間縮短。Circ-TFCP2L1通過海綿化miR-7來降低PAK1的表達，從而誘導TNBC的增殖和遷移[9]。CircPLK1通過競爭性結合miR-296-5p，增加Plk1合成，最終可促進細胞增殖[10]；CircAGFG1作為miR-195-5p的“海綿”，可緩解miR-195-5p對CCNE1的抑制作用，從而加速細胞分裂和增殖[11]。CircRNA_069718在TNBC組織和細胞中表達明顯增加，降低circRNA_069718的表達可抑制Wnt/β-catenin信號通路來減少β-catenin、原癌基因、cyclin D1的表達，進而抑制TNBC的增殖[12]。與之相反，circ-ITCH的顯著下調與TNBC的不良預后有關，circ-ITCH可以結合miR-214和miR-17并增加ITCH的表達，從而滅活Wnt/β-catenin信號，抑制TNBC的增殖[13]。

低氧是乳腺腫瘤微環境的主要特征之一。低氧可通過circRNA-miRNA-mRNA軸調控乳腺癌細胞分化、增殖及轉移。CircDENND4C可競爭性結合miR-200b和miR-200c，而下調circDENND4C的表達可通過促進miR-200b和miR-200c的表達進而抑制乳腺癌細胞的糖酵解、轉移和侵襲能力[14]。低氧微環境會誘導乳腺癌細胞中HIF1α相關的circDENND4C表達，而敲除circDENND4C基因，可以抑制低氧環境下乳腺癌細胞的增殖和轉移[15]。

4.2 CircRNA調控乳腺癌(BC)細胞轉移

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌細胞獲得侵襲能力的重要途徑，指上皮細胞失去細胞極性以及與基底膜間的連接，進而獲得高轉移、抗凋亡和可降解細胞外基質等特性。CircANKS1B通過競爭性結合miR-148a-3p和miR-152-3p來增加轉錄因子USF1的表達，進而激活TGF-β1/Smad信號、促進EMT，最終促進了TNBC的侵襲轉移[16]。Hsa_circ_001569基因表達下調可減少PI3K/AKT通路激活和抑制EMT效應，并因此抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[17]。Circ-TFF1和TFF1在BC中均過表達且呈正相關。Circ-TFF1在體外可促進BC細胞增殖、遷移、侵襲和EMT，在體內可通過海綿化miR-326增加TFF1表達，促進BC細胞增殖[18]。CircRNA-miRNA-mRNA軸可能在乳腺癌轉移癌的治療中發揮重要作用。Hsa_circ_21439和hsa_circ_11783分別是肝轉移癌組織細胞中表達上調和下調最顯著的circRNA，且這兩種circRNA可以作為ceRNA發揮作用，可能是乳腺癌肝轉移潛在的治療靶點[19]。

4.3 CircRNA調控乳腺癌(BC)化療耐藥

乳腺癌耐藥特征是影響乳腺癌治療的重要因素之一。阿霉素、他莫西芬、單星素已被廣泛應用于乳腺癌患者的化學藥物治療(簡稱化療)，circRNA主要參與了這3種化療藥物的耐藥作用。

阿霉素是一種抑制DNA和RNA合成的臨床用廣譜抗腫瘤藥物。CircKDM4C可競爭性結合miR-548p，而上調miR-548p的表達可逆轉circKDM4C誘導的乳腺癌細胞惡性表型減弱和PBLD的表達升高[20]。CircKDM4C在體內外均可顯著抑制乳腺癌的增殖和轉移，并減緩乳腺癌患者對阿霉素的耐藥。與阿霉素敏感組相比，hsa_circ_0006528在阿霉素耐藥細胞系和組織中表達水平更高。相關機制可能為hsa_circ_0006528競爭性結合miR-7-5p，從而抑制Raf1相關MAPK信號通路，促進乳腺癌阿霉素耐藥的發生[21]。

他莫昔芬是一種主要用于雌激素受體陽性乳腺癌患者的非甾體類藥物。CircBMPR2在人乳腺癌組織中表達顯著下調，同時circBMPR2的下調可抑制他莫昔芬誘導的細胞凋亡，促進乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥[22]。Hsa_circ_0025202在乳腺癌組織中表達明顯降低，其可通過競爭性結合miR-182-5p來調控FOXO3a的表達和活性，抑制腫瘤細胞增殖和轉移，增加乳腺癌細胞凋亡和對他莫昔芬的敏感性[23]。此外，上調circRNA CDR1-AS的表達，可通過抑制hsa-miR-7功能，減少了他莫昔芬治療乳腺癌的不良反應，增強乳腺癌復發患者療效[24]。

單星素是一類作用于有絲分裂紡錘體的乳腺癌化療藥物，能通過抑制有絲分裂驅動蛋白Eg5活性發揮腫瘤抑制作用。CircRNA-MTO1在單星素耐藥細胞中表達水平升高，此外circRNA-MTO1可通過結合TRAF4，并抑制TRAF4所激活的Eg5翻譯從而抑制Eg5蛋白水平，證實circRNA-MTO1的調控機制可影響乳腺癌細胞生存力和單星素耐藥性[25]。

5 問題與展望

作為新興的調控分子，circRNA參與了乳腺癌的增殖、侵襲、轉移和化療耐藥。CircRNA主要通過ceRNA機制調控乳腺癌相關基因的表達，從而發揮致癌或抑癌作用。然而，關于circRNA的研究還處于方興未艾階段，仍有許多問題有待探索，如circRNA命名缺乏統一標準，以及circRNA乳腺癌中的功能和機制的研究還比較少；而且，闡明乳腺癌中circRNA的生物發生、降解、細胞定位和作用機制仍然至關重要；此外，circRNA對乳腺癌治療主要聚焦于化療藥物耐藥特性，而circRNA對其他免疫治療、放射治療等抵抗作用還知之甚少，也需要格外的關注。深入了解circRNA在乳腺癌中的作用機制和耐藥影響，將促進乳腺癌治療策略的開發，以及有益于乳腺癌相關的早期篩查、精準診斷和預后監測等諸多領域。