聚乙烯醇/ε-聚賴氨酸水凝膠傷口敷料的制備及性能

范 瑤， 梁文城， 王友長， 郎美東

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237）

皮膚是人體最大的組織器官，容易受到外界傷害[1,2]。當(dāng)皮膚受損時，需要傷口敷料構(gòu)建一道抵御外界二次傷害的屏障[2]。理想的傷口敷料需要在創(chuàng)面提供潮濕的微環(huán)境，吸收傷口滲出液，允許氣體交換，并且具有優(yōu)異的抗菌活性[3,4]。紗布和棉花等傳統(tǒng)傷口敷料易與組織黏連，不易移除且抗菌活性低[5]，因此已有許多新型傷口敷料（如海綿[6]、水凝膠[7]、薄膜等[8]）被研究，其中水凝膠與其他傷口敷料相比可維持傷口濕潤，促進傷口壞死組織自溶性清創(chuàng)[9]，近年來在傷口敷料方面的應(yīng)用備受關(guān)注。

聚乙烯醇（PVA）水凝膠由于具有良好的生物相容性、親水性和生物降解性，已經(jīng)在傷口敷料領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[10]。PVA 可以通過凍融法進行物理交聯(lián)制備水凝膠[11]，但力學(xué)性能欠佳[10]。在PVA 的水凝膠網(wǎng)絡(luò)中引入交聯(lián)劑以進一步提升其力學(xué)性能[12]，然而常見的交聯(lián)劑有一定的細胞毒性[13]。檸檬酸（CA）是一種無毒且可生物降解的綠色交聯(lián)劑，在生物基水凝膠中得到了廣泛應(yīng)用[14,15]。

抗菌性能是傷口敷料的一項重要指標(biāo)，因為細菌會引發(fā)嚴重的炎癥，進而延緩傷口愈合，但PVA 水凝膠缺乏抗菌活性，極大限制了其在傷口敷料領(lǐng)域的應(yīng)用[16]。通常采用化學(xué)接枝或者物理共混的方法引入抗菌劑，開發(fā)具有抗菌效果的改性PVA 水凝膠[9]。ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種天然多肽抗菌劑[17]，具有高水溶性、高熱穩(wěn)定性和低毒性[18-20]等優(yōu)點，對真菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等都具有顯著抑制效果[21,22]，因此在食品防腐、藥物遞送、涂層材料[23,24]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。雖然ε-PL 具有良好的抗菌活性，然而使用ε-PL 制備傷口敷料的研究較少。

本文以PVA 作為基體材料，向其中引入ε-PL 和CA，采用凍融法制備PVA 基復(fù)合水凝膠PVCL。系統(tǒng)研究了ε-PL 質(zhì)量分數(shù)對復(fù)合水凝膠形貌、力學(xué)性能、熱力學(xué)性能、結(jié)晶性能以及溶脹行為的影響。此外，分析PVCL 復(fù)合水凝膠的溶血行為，通過菌落計數(shù)法檢測水凝膠對大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）的抗菌能力，采用CCK-8 法和活/死細胞染色法檢測PVCL 復(fù)合水凝膠對間充質(zhì)干細胞（MSCs）的細胞毒性，評估該復(fù)合水凝膠在傷口敷料領(lǐng)域的應(yīng)用前景。研究表明ε-PL 可增強水凝膠的抗菌活性，CA 可以進一步提高水凝膠的力學(xué)性能。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

PVA：Mw=1.45×105，型號117，分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；ε-PL：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；CA：分析純，上海阿拉丁試劑公司；蛋白胨和酵母粉：生化試劑，上海弘仁生物科技發(fā)展有限公司；瓊脂：生化試劑，北京博立生物科技有限公司；E.coli（型號BNCC 336 953）、S.aureus（型號BNCC 340 652）：生化試劑，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 表征

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀：美國Thermo Scientific 公司Nicolet 6 700 型，熱涂法，波長范圍400～4 000 cm?1；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司S-3400N 型；萬能拉伸試驗機：美國BOSE 公司Load Frame 3 200 System 型，拉伸速率為10 mm/min；差示掃描量熱（DSC）：美國PerkinElmer 公司DSC8500 型，N2氛圍，升溫速率為10 ℃/min，升溫區(qū)間為25～250 ℃，結(jié)晶度χc=ΔHm/（w×ΔH0）×100%，其中ΔHm是樣品的熔化熱，w是PVA 的質(zhì)量分數(shù)，ΔH0是結(jié)晶度為100% PVA 的熔化熱（138.6 J/g）；多功能酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices 公司SpectraMax M2 型。

1.3 PVCL 的制備

首先，稱取一定量的PVA 于去離子水中，在95 ℃攪拌4 h 至PVA 溶解，得到透明溶液。然后，配制w=15%的PVA 水溶液，加入CA（水溶液質(zhì)量的3%）和ε-PL（分別為水溶液質(zhì)量的0、1%、3%、5%、7%）在一定溫度下攪拌24 h，制備均勻混合的溶液。最后，將混合后的溶液超聲30 min 消泡，氣泡除盡后倒入塑料培養(yǎng)皿模具中，放入冰箱，在?20 ℃冷凍48 h，于室溫自然解凍，冷凍-解凍過程循環(huán)3 次制備出復(fù)合水凝膠，分別標(biāo)記為PVCL-0、PVCL-1、PVCL-3、PVCL-5、PVCL-7，其制備過程如圖1 所示。

圖1 PVCL 的制備過程Fig. 1 Preparation process of PVCL

1.4 性能測試

1.4.1 水凝膠的溶脹率 將干燥后的水凝膠（質(zhì)量為m0）在37 ℃的磷酸緩沖鹽（PBS）溶液中浸泡24 h，然后從PBS 溶液中移出（質(zhì)量為m1），用濾紙將表面多余的水分去除。水凝膠的溶脹率（SR）計算公式如下：

1.4.2 水凝膠的抗菌實驗 將水凝膠與E.coli和S.aureus在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)6 h，然后梯度稀釋，接著取20 μL稀釋后的細菌懸液涂布于瓊脂平板中，將瓊脂平板放在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；最后根據(jù)平板上的菌落數(shù)計算抗菌率（AR），計算公式如下：

其中：Nc和Ns分別為對照組和抗菌處理組瓊脂平板上的菌落數(shù)量，以PVA 水凝膠作為對照組。

1.4.3 水凝膠的溶血率 使用抗凝兔血測定水凝膠的溶血率。將紅細胞使用PBS 溶液稀釋25 倍后與水凝膠在37 ℃下共培養(yǎng)1 h。將紅細胞懸液分別與PBS 溶液和去離子水共培養(yǎng)，作為陰性對照組和陽性對照組。共培養(yǎng)后的紅細胞懸液用離心機在1 500 r/min 的條件下離心10 min，用酶標(biāo)儀測定上清液在545 nm 處的吸光度（OD）。溶血率（HR）的計算公式如下：

其中：ODsample、ODpositive和ODnegative分別對應(yīng)水凝膠、陽性對照組和陰性對照組上清液的吸光度。

1.4.4 水凝膠的細胞毒性 采用CCK-8 法檢測水凝膠對MSCs 的細胞毒性。將滅菌后的水凝膠置于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）溶液中浸泡48 h 制備浸提液。將MSCs 接種于48 孔板中（每孔1×104個細胞），與浸提液在CO2體積分數(shù)為5%的生化培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，溫度為37 ℃。其中MSCs 與PVA 水凝膠浸提液共培養(yǎng)作為對照組。最后，用酶標(biāo)儀測定CCK-8 染色細胞懸液在450 nm 處的OD 值。與水凝膠浸提液共培養(yǎng)后的細胞存活率（CV）為對應(yīng)樣品組和對照組的吸光度比值。

采用活/死染色法測定24 孔板上間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)。制備水凝膠浸提液，將MSCs 接種于24 孔板（每孔1.0×104個細胞），與浸提液在生化培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h。其中MSCs 與PVA 水凝膠浸提液共培養(yǎng)作對照組。鈣黃綠素-AM/碘化丙啶混合物與細胞共培養(yǎng)30 min，然后用PBS 溶液洗滌3 次，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica Microsystem）觀察細胞形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠的紅外光譜圖

圖2 是水凝膠樣品的紅外光譜圖。PVA 在3 300～3 500 cm?1處的寬峰為-OH 的伸縮振動峰，2 929 cm?1和2 851 cm?1處出現(xiàn)的峰為-CH2的伸縮振動峰，1 632、1 378 cm?1和1 093 cm?1處分別為-OH 的彎曲振動峰、-CH 的彎曲振動峰和-C-O 的伸縮振動峰[25]。PVCL-0 在1 710 cm?1處出現(xiàn)了新峰，為CA 中羧基的特征峰。引入ε-PL 后，在3 300～3 500 cm?1處為-OH 和-NH2的重疊峰，且峰形變得寬而鈍。與PVCL-0 相比，引入ε-PL 后的水凝膠在1 587 cm?1處出現(xiàn)了-NH 的伸縮振動峰，1 270 cm?1處的峰為C-N 伸縮振動峰，表明成功制備了PVCL 復(fù)合水凝膠。

圖2 水凝膠的FT-IR 譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of hydrogels

2.2 水凝膠的形貌分析

水凝膠的表面形貌如圖3 所示。由圖3 可知，所有水凝膠樣品均呈現(xiàn)相互連接的孔狀結(jié)構(gòu)。這是由于使用凍融法制備PVA 基水凝膠，大多數(shù)水在冷凍過程中形成了冰晶，當(dāng)水凝膠解凍時，這些冰晶融化并形成多孔結(jié)構(gòu)。PVA 水凝膠的表面粗糙，孔結(jié)構(gòu)致密（圖3（a）），在加入CA 后，表面變得更加致密（圖3（b）），而在引入ε-PL 后，水凝膠表面的孔洞逐漸增多，顯示出多孔互連的微觀結(jié)構(gòu)（圖3（c）～3（f）），這樣的結(jié)構(gòu)允許氣體交換，可以吸收傷口滲出液，并且潮濕的微環(huán)境有利于傷口愈合。

圖3 水凝膠的掃描電鏡圖Fig. 3 SEM images of hydrogels

2.3 水凝膠的力學(xué)性能

水凝膠的力學(xué)性能如圖4 所示。純PVA 水凝膠的拉伸強度為1.8 MPa，PVCL-0 的拉伸強度為3.0 MPa，提高了66.7%；斷裂伸長率由355.9%增加到426.5%，提高了19.8%。這是因為加入CA 后，CA 與PVA 之間的氫鍵形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并且小分子CA 可以作為增塑劑提高PVCL-0 水凝膠的拉伸強度和斷裂生長率。加入ε-PL 后，隨著ε-PL 含量的增大，拉伸強度和斷裂伸長率均呈現(xiàn)先小幅增加后逐漸下降的趨勢，這是由于隨著ε-PL 的加入，ε-PL 的-NH2和PVA 的-OH 基團之間形成氫鍵，但是隨著ε-PL 含量的增加，PVA 之間的距離增大，破壞了PVA 分子間氫鍵的作用力，導(dǎo)致拉伸強度和斷裂伸長率均呈現(xiàn)一定程度的下降。

圖4 水凝膠的力學(xué)性能Fig. 4 Mechanical properties of hydrogels

2.4 水凝膠的熱性能

水凝膠的DSC 分析結(jié)果如表1 所示。PVCL-0的結(jié)晶度為46.1%，明顯高于PVA 的41.4%，這是由于PVA 與CA 之間形成氫鍵導(dǎo)致熔融溫度升高。隨著ε-PL 含量的增加，結(jié)晶度也呈現(xiàn)先增大再下降的趨勢，這是由于少量的ε-PL 可以與PVA 之間形成氫鍵，促使熔融溫度有一定升高，此外，ε-PL 含量增加導(dǎo)致PVA 之間間距增大，交聯(lián)減少，熔融溫度降低，結(jié)晶度降低。

表1 水凝膠的DSC 分析結(jié)果Table 1 DSC analysis results of hydrogels

2.5 水凝膠的溶脹率

水凝膠的溶脹率如圖5 所示。PVA 的溶脹率為245.2%，加入CA 后，PVCL-0 的溶脹率降低為235.3%，這是因為PVCL-0 結(jié)晶度較高，對溶脹率有抑制作用。隨著ε-PL 的含量增加，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的密度降低，溶脹率逐漸增加。PVCL-7 的溶脹率最大，為293.7%。因此以PVA 為基體的水凝膠是水溶脹型聚合物，可以吸收傷口滲出液，促進傷口愈合。

圖5 水凝膠的溶脹率Fig. 5 Swelling rates of hydrogels

2.6 水凝膠的抗菌活性

從水凝膠的抗菌效果圖（圖6（a））可知，PVA 板的菌落數(shù)量較多，隨著ε-PL 含量的增加，瓊脂板上的細菌菌落數(shù)量逐漸減少，PVCL-5 和PVCL-7 平板上基本沒有觀察到細菌的生長。使用菌落計數(shù)法測定水凝膠傷口敷料對E.coli和S.aureus的抗菌率（圖6（b）），以PVA 水凝膠作為對照組，隨著ε-PL 含量的增加，抗菌活性進一步提升，PVCL-5 和PVCL-7 對E.coli和S.aureus的抗菌率均接近100%。這是由于ε-PL 是一種陽離子多肽，與細菌的細胞膜接觸可以增加細胞膜的通透性，并進一步導(dǎo)致細胞質(zhì)泄露，進而殺死細菌。因此，添加ε-PL 可以增強PVCL 水凝膠的抗菌能力。

圖6 水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的（a）抗菌效果圖和（b）抗菌率Fig. 6 （a）Antibacterial effect and （b） antibacterial rate of hydrogel against E.coli and S.aureus

2.7 水凝膠的溶血率

圖7（a）為水凝膠溶血效果圖，與陽性對照組相比，PVCL 復(fù)合水凝膠上清液均無色透明，無溶血現(xiàn)象。水凝膠溶血率如圖7（b）所示，復(fù)合水凝膠的溶血率隨著ε-PL 含量的增加而增加，PVCL-7 溶血率最高，為1.4%。這是由于ε-PL 為陽離子多肽，陽離子增多會破壞紅細胞的細胞膜，導(dǎo)致溶血率增大。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織10993-4 規(guī)定，溶血率小于5%即可認為具有良好的血液相容性。因此，PVCL 水凝膠滿足傷口敷料的要求，具有較好的血液相容性。

圖7 水凝膠的（a）溶血效果圖和（b）溶血率Fig. 7 （a） Hemolysis effect and （b） hemolysis rates of hydrogels

2.8 水凝膠的細胞毒性

MSCs 的細胞存活率如圖8（a）所示。與對照組PVA 相比，PVCL 水凝膠的細胞存活率均大于89%，隨著ε-PL 含量的增加，細胞存活率逐漸降低，表明ε-PL 含量增加會導(dǎo)致陽離子含量增加，進而破壞細胞膜，導(dǎo)致細胞死亡。

活/死細胞染色實驗結(jié)果如圖8（b）所示。活細胞發(fā)出綠色熒光，死細胞發(fā)出紅色熒光。由圖8（b）可以看出，所有組的細胞呈紡錘狀，大多數(shù)細胞呈現(xiàn)綠色熒光，PVCL-5 和PVCL-7 組可以觀察到極少數(shù)紅色熒光，表明隨著ε-PL 含量的增加，細胞毒性增大。圖8 表明，通過調(diào)節(jié)ε-PL 的含量可控制細胞毒性。

圖8 （a）水凝膠的細胞存活率和（b）活/死細胞染色圖Fig. 8 （a） Cell viability of hydrogels and （b） images of living/dead cell staining

3 結(jié) 論

（1）采用凍融法成功制備出PVCL 水凝膠。

（2）雖然PVCL 水凝膠滿足傷口敷料所需的力學(xué)性能要求，但是隨著ε-PL 含量的增加，力學(xué)性能逐漸降低，溶脹率逐漸增加。

（3）隨著ε-PL 含量的增加，PVCL 的抗菌活性增加，PVCL-5 和PVCL-7 的抗菌率均接近100%。

（4）PVCL 水凝膠具有低毒性與較好的生物相容性，適合傷口敷料的應(yīng)用，滿足作為傷口敷料的生物安全要求。