外泌體在膽管細胞癌中的研究進展

慈鴻飛 賈戶亮

（復旦大學附屬華山醫院普外科 上海 200040）

膽管細胞癌（cholangiocarcinoma，CCA）于1840年首次被報道，然而當時這一疾病并沒有受到人們的重視，直到100年后才有系統的綜述介紹CCA［1-2］。CCA可以起源于膽道的任何位置，臨床上多數按解剖學位置將其分為肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）、肝門部膽管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）和遠端膽管 癌（distal cholangiocarcinoma，dCCA），60%的CCA都發生在肝膽管分叉處［3］。大多數CCA患者早期無明顯癥狀，有些患者直到晚期發生了膽道梗阻才來就診，目前常規超聲篩查難以發現早期的小病灶，確診時間較晚也是導致CCA總體5年生存率小于10%的原因之一。因此，尋找特異的生物學標志物，早期篩查出CCA已成為目前臨床關注的重點［4］。

外泌體是由內涵體分泌產生的直徑在30～150 nm的胞外囊泡（extracellular vesicle，EV），根據大小、功能、運輸方式等不同，胞外囊泡還包括微泡（microvesicles）、凋亡小體（apoptosis bodies）等［5］。細胞分泌外泌體這一現象最早是在1983年由Johnstone等［6］在培養綿羊網織紅細胞時發現，但是當時認為其只是細胞處理代謝廢物的一種途徑，在1987年的后續研究［7］中將這種特殊的囊泡命名為外泌體。目前已知外泌體參與的生理過程有器官發育、抗原呈遞和免疫反應、神經元通信及控制和細胞增殖等過程［8］。由于外泌體不但能夠在體液中穩定廣泛存在，而且能夠攜帶有細胞的特異分子，這就為探究外泌體相關腫瘤標記物、載藥治療技術提供了可能。

隨著分子生物學技術的進步，不同外泌體攜帶的組分逐漸被鑒定出來。盡管外泌體的來源細胞特性高度影響外泌體成分的表達，但一些蛋白諸如四次跨膜蛋白（CD9、CD26、CD58）、Rab蛋白家族、熱休克蛋白家族（Hsp70、Hsp90）、核內體相關蛋白（Alix、TSG101）等都是常見的共同表達成分［9］。外泌體中的核酸分子無論是DNA還是編碼的mRNA和非編碼RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）都沒有缺席，這豐富了外泌體對于靶細胞表達調控的機制。此外，外泌體的膜上還能檢測到多種豐富的脂質，如磷脂酰絲氨酸和膽固醇［10］。

外泌體中的核酸分子在CCA中的作用

環狀RNA環狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼長鏈RNA的一種，共價閉環的結構是它的特征，由于沒有極性和polyA尾部結構，具有相對無干擾的結構框架；并且circRNA在真核轉錄組中表達具有高度特異性，這使得circRNA在一些疾病中扮演分子標志物的角色［11-12］。

研究發現，circ-0000284在膽管癌細胞系分泌的外泌體中表達增多，并具有明顯的促進遷移、侵襲的能力［13］。該團隊也發現circ-0000284能夠作為miRNA海綿與miR-637結合抑制其作用，同時在結腸癌中發現其與miR-7也有類似機制［14］。有研究發現circ-0000284在肝癌細胞中顯著上調，促進腫瘤細胞增殖；而另有研究發現該分子也可以抑制膀胱癌的生長和轉移［15-16］。circ-0000284究竟是致癌還是抑癌分子還需要更深入的研究。

circ-CCAC1是新發現的在CCA組織和膽汁外泌體中都過表達的circRNA，發揮功能時circ-CCAC1主要通過海綿作用結合miR-514a-5p上調陰陽蛋白1（Yin-Yang 1，yy1）表達，進一步激活鈣調親環蛋白配體（calcium signal-modulating cyclophilin ligand，CAMLG）來促進CCA進展，這也是首次證明circ-CCAC1/miR-514a-5p/yy1/CAMLG軸在CCA中的重要性，而且CCA分泌的攜帶circ-CCAC1的外泌體還有促進血管內皮細胞生成的作用，因此CCA組織和膽汁的外泌體中都上調的circ-CCAC1被認為可能是一種CCA潛在標記物［17-18］。

在CCA患者中高表達的circDNM3OS與腫瘤的大小、TNM分期和淋巴結浸潤有關，這一現象是circDNM3OS通過海綿作用于miR-145-5p后上調致癌基因MORC2，促進了CCA細胞的惡性轉化和谷氨酰胺代謝［19-20］。不過該分子在外泌體中的表達情況還未有實驗驗證。

miRNA miRNA（microRNA）因為具有靶向mRNA的能力而在轉錄后調控中扮演重要角色，并參與各種生理、病理過程［21］。研究發現血漿或膽汁中都存在核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），并且外源性miRNA會被降解以維持機體穩態，內源性miRNA能夠穩定發揮作用的機制目前尚未完全確定，但外泌體作為miRNA的主要載體保護其不被分解已經得到驗證［22-24］。外泌體miRNA的功能中，與CCA相關的研究主要是作為生物標記物的功能［25］。

有研究比較CCA細胞系來源的外泌體中miRNA與膽管上皮細胞的差異，在CCA中miR-205-5p上調最明顯，miR-199a-5p下調最明顯，通過京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析發現這些差異miRNA與癌癥相關的途徑有顯著的關聯［26］。隨后在CCA患者血清中檢測外泌體來源miRNA，篩選出5個有顯著差異的miRNA分子，其中MiR-200家族中有4個microRNA（miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p和miR-200C-3p）的AUC高于CA19-9（0.78），miR-200a/c-3p不僅是診斷CCA的生物標志物，且濃度與CCA分期成正相關，這使其成為反映疾病進展的指標［27］。

治療方面，在CCA及其基質中下調的外泌體中的miR-195能夠抑制CCA的生長和侵襲能力，CCA小鼠模型中注入包裹miR-195的外泌體后也觀察到同樣的現象，但是具體機制還不清楚［28］。有關miRNA的實驗室研究較多，而臨床試驗相對較少，因此還需要更多的臨床數據驗證實驗室結果［29］。

mRNA早在2007年研究者就觀察到，將鼠源的外泌體與人肥大細胞體外共培養后，肥大細胞表達鼠源特異性蛋白，便推測外泌體中mRNA有能夠到靶細胞翻譯的功能。目前基于外泌體攜帶功能性mRNA的核酸療法備受關注，通過外泌體的載體特性可能更好地解決mRNA無法有效遞送至目標組織或細胞的問題［30-31］。

Haga等［32］將CCA細胞系提取出來的外泌體與骨髓間充質干細胞共培養后，增強了間充質干細胞的遷移能力和α-平滑肌肌動蛋白mRNA的表達，以及CXCL-1、CCL2和IL-6 mRNA的表達和釋放，通過將外泌體與膽管癌細胞中mRNA比較，發現外泌體中相關mRNA顯著上調，因此推測是CCA外泌體攜帶的mRNA釋放到間充質細胞中發揮了作用［32］。隨著分子生物學技術的進步，有多篇文獻報道了運用多組學技術檢測CCA患者血清及尿液分子中可用作標記物的mRNA，但篩選出多個特異分子而未進行深入的臨床及分子機制研究，距離用于臨床解決實際問題還有較遠距離［33］。

外泌體中的蛋白質分子在CCA中的研究外泌體所攜帶的蛋白質一般分成非特異性和特異性兩大類：非特異性蛋白包括細胞骨架蛋白、與轉運有關的四跨膜蛋白家族成員（CD9、CD63、CD81和CD82）、熱休克蛋白、整合素等，在研究中主要作為外泌體鑒定的標志物；特異性蛋白主要與分泌細胞有關，隨著疾病的進展，含量和定位會有明顯變化［34-35］。目前外泌體相關文獻中，對于蛋白質的研究只占了小部分，但是隨著蛋白質組學技術的發展，對于蛋白質在外泌體功能方面的關注越來越多，外泌體蛋白質的研究不僅能增加對其生物學作用機制的認識，還可能發現新的生物標志物［36］。當前對于CCA相關外泌體中蛋白質的鑒定方法以蛋白質質譜為主，而外泌體來源有多種方式，包括患者血漿提取、體外培養的CCA細胞上清液提取、動物原位CCA模型的血漿提取以及直接從人CCA組織提取，由于外泌體來源和質譜的參數不同，得到的差異蛋白的種類和數量也不同［37-39］。

有研究對比了CCA患者與健康人血清中外泌體蛋白質譜，試圖找出具有診斷意義的差異蛋白，在其中AUC值與敏感性最高的是氨肽酶N（aminopeptidase N，APN），APN用于篩查CCA的敏感性超過常用指標CA199，但特異性略低［38］。APN是一種可以裂解蛋白質N端氨基酸的鋅酶，屬于M1鋅金屬肽酶家族成員，在多種腫瘤及其周圍血管組織都有發現［40］。APN關注焦點是作為檢測肝細胞肝癌干細胞的標記物，而CCA中癌癥干細胞的比例遠高于大多數實體瘤，因此推測血清中外泌體APN的升高與CCA的進展存在關聯，其中具體機制還需要進一步的探索［41-42］。

除了血清，膽汁也是重要的膽管癌外泌體來源之一。最近有研究使用組學分析比較了CCA患者和膽結石患者膽汁中外泌體攜帶的蛋白質，發現Claudin-3具有作為CCA生物標記物的潛力，因為其表達升高顯著，敏感性和差異性都高達0.875［39］。Claudin-3具有不依賴鈣離子的細胞黏附活性，在緊密連接細胞、消除細胞間隙、細胞旁運輸以及細胞增殖遷移中起重要作用，在結腸癌中Claudin-3的表達上調會破壞緊密連接的穩定性，導致大分子的細胞旁通量增加，促使細胞遷移和集落形成的誘導，不過這一現象還未在CCA中得到驗證［43-44］。

通過對CCA細胞系與正常人膽管上皮細胞系H69培養后分離出的外泌體蛋白質質譜組學分析，篩選出38種差異表達蛋白，差異最大的是半乳糖凝集素3結合蛋白（lectin galactoside binding soluble 3 binding protein，LG3BP），也被稱為MAC2BP、M2BP［37］。將CCA細胞分離出的外泌體與H69細胞系共培養，發現CCA細胞系的外泌體增強了H69細胞的轉移和侵襲能力，而對其增殖能力影響不大，但該研究樣本數量較少，有待進一步驗證。LG3BP為一種分泌蛋白，廣泛存在于細胞外基質中，在正常人的肝組織中表達量較低，參與調節Wnt蛋白的胞外擴散，提示其在腫瘤的免疫逃逸中有重要作用［45］。研究發現，LG3BP在高復發風險的子宮內膜癌患者血清外泌體中富集，在人類大腸癌和前列腺癌的細胞外基質中表達升高［46-47］。LG3BP曾經被認為是一種用于診斷非酒精性肝硬化及丙型肝炎等慢性肝病的標志物，然而最近有研究對其診斷效能產生了質疑，借助外泌體來提高LG3BP的診斷效能可能成為一個新的突破點［48-49］。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）及其下游的信號通路參與調節多種生物學功能，包括細胞增殖、分化、組織修復、血管生成等，成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）軸的異常激活是腫瘤發生的重要因素［50］。最近的研究發現，iCCA中幾種不同的FGFR2基因有較高的概率發生融合，但是pCCA/dCCA中幾乎沒有融合，這提示發生在不同位置的CCA可能在起源上存在差異［51-52］。FGFR2融 合蛋白通過激活絲裂原活化蛋白激酶來激活FGFR相關通路，并促進非錨位生長；存在FGFR異位的腫瘤中FGFR的結合配體介導低聚化和相應的FGFR激酶的激活，這些基因融合現象的發現為靶向治療提供幫助，首個針對膀胱癌FGFR突變位點的靶向藥物厄達替尼在2019年4月被FDA批準上市［53-54］。FGF2被骨髓基質細胞分泌到外泌體中，攜帶FGF2的外泌體被白血病細胞攝取后能夠逃脫化療藥物的攻擊，但關于CCA進展中是否存在外泌體相關FGF家族的現象還需要進一步研究［55］。

胞質異戊檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase［NADP］cytoplasmic，IDH1）是一種能催化異檸檬酸還原型NADP生成α酮戊二酸的酶，IDH1基因突變現象在多種腫瘤中都有發現，IDH1突變通過抑制其正常催化的反應來起到負性調節作用［56］。研究發現IDH1突變的膽管癌細胞系中外泌體分泌量明顯減少，通過通路分析推測可能是一種ATP受體P2RX7高表達導致的，與P2RX7共表達的基因多與外泌體的釋放和定位相關，該發現是IDH1突變的CCA在外泌體研究中的首次嘗試［57］。

結語CCA作為肝膽系統第二高發的癌癥，近年來發病率和死亡率都有上升的趨勢，臨床工作中應對該疾病有足夠的重視，當務之急是開發出高效的早期診斷手段。外泌體是近年來新發現的細胞間信息交流信使，分布廣泛且穩定性好，擁有疾病診斷和靶向治療的潛能是外泌體目前廣受關注的重要原因。當前限制外泌體領域進展的一大因素是外泌體富集和純化技術，目前尚無實現高通量、高純度、高速率的外泌體提取方法。總體來說，外泌體應用于CCA的診療研究數量較少，這可能與CCA的患者基數較小有關，雖然已有幾個基于外泌體的組學研究篩選出的潛在標記物，但尚無后續的深入研究能夠得到可靠的依據。外泌體應用于診斷還處于早期階段，隨著研究深入，外泌體應用于CCA這一類高度惡性腫瘤的早期診斷具有深遠的臨床意義。

作者貢獻聲明慈鴻飛文獻檢索，論文設計和撰寫。賈戶亮論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。