基于網絡藥理學的中藥組方“芩部丹”治療肺結核作用機制研究

莊麗 馬子風 蔣雨薇 黃星 張惠勇 鹿振輝 吳顯偉

肺結核屬中醫學“肺癆”病癥的范疇，是因癆蟲侵襲肺臟，肺陰虧耗，肺絡損傷所致的慢性肺系疾病，中醫藥在肺結核的認識與防治中具有獨特的見解與優勢。“芩部丹”由黃芩、百部、丹參組成，是上海市名老中醫邵長榮教授創立的結核病經驗組方。近年來，“芩部丹”及其復方治療肺結核的臨床與基礎研究取得了一定進展，芩部丹片聯合西藥基礎治療方案治療復治肺結核患者的病灶顯著吸收率為67.7%，空洞閉合率為25.5%，優于單純西醫治療[1]。難治性肺結核(經過初治、復治均未取得理想治療效果的肺結核)患者服用芩部丹片的臨床痰菌陰轉率為34.5%[2]。芩部丹復方具有改善氣陰兩虛型耐多藥肺結核患者臨床癥狀和生存質量，促進痰菌陰轉、空洞閉合的臨床療效[3-4]。中藥復方治療肺結核的臨床療效顯著且安全可靠，具有多靶點、多層次的干預特點，但這也對中藥復方的機制研究提出了較大的挑戰。本研究借助網絡藥理學的研究理論與手段，從分子生物學角度對“芩部丹”治療肺結核的作用機制進行初步探索，也為中藥組方“芩部丹”的臨床應用與研發提供一定的參考。

資料和方法

一、“芩部丹”組方活性成分的獲取與靶點預測

選取《中藥系統藥理學數據庫與分析平臺》[5](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，簡稱“TCMSP數據庫”；http：//tcmspw.com/tcmsp.php/)對“芩部丹”中的三味中藥(黃芩、百部、丹參)所含有的化學成分進行查詢，將口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為標準對所有成分進行篩選，以獲得在人體中藥代動力學較好的生物活性成分。進而匯總篩選得到藥物成分，在TCMSP數據庫中搜集藥物活性成分對應的預測蛋白靶點，將結果導入到Uniprot平臺(https://www.uniprot.org/)中替換成符合命名規范的基因靶點名稱，以用于后續的研究與分析。

二、肺結核疾病靶點的獲取

以“pulmonary tuberculosis”(肺結核)為關鍵詞輸入GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、OMIM(https://www.omim.org/)和TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數據庫中查找肺結核的相關基因靶點。其中，對GeneCards數據庫中的得分大于中位數的靶點予以保留，最終將多個靶點數據集進行整合，得到最終的肺結核疾病相關靶點。

三、“芩部丹”組方治療肺結核的藥物-成分-靶點網絡構建及分析

將黃芩、百部、丹參活性成分的預測基因靶點進行匯總，去除重復項。對“芩部丹”與肺結核的基因靶點取交集，提交至在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/login/)中繪制韋恩圖。為了更加直觀地了解“芩部丹”藥物成分對肺結核疾病靶點的作用情況，將“芩部丹”治療肺結核的基因靶點帶入Cytoscape 3.7.1軟件中完成藥物-成分-靶點網絡圖的構建，根據介數中心性(betweenness centrality，BC)、緊密中心性(closeness centrality，CC)和連接度(Degree)的大小對各個節點的重要程度進行排序與篩選分析，得到“芩部丹”治療肺結核的主要活性成分。

四、“芩部丹”組方治療肺結核作用靶點的PPI網絡構建

將“芩部丹”治療肺結核疾病的靶點輸入到STRING 11.0平臺(https：//string-db.org/)建立預測靶點的蛋白互作(PPI)模型[6]。進而下載蛋白互作關系的數據表格，以Cytoscape 3.7.1軟件為工具計算靶點的連線關系，通過計算BC、CC和Degree 值選取“芩部丹”治療肺結核的核心靶點。

五、“芩部丹”組方治療肺結核的靶點功能及通路分析

運用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線數據庫平臺，獲取GO功能及KEGG通路的富集分析，保留P值小于0.05的部分作為富集分析的結果，運用bioinformatics在線網站對結果進行可視化呈現。對KEGG 通路分析的結果進行文獻檢索與總結分析，篩選研究、報道中與肺結核相關的信號通路，對“芩部丹”在這些通路上的作用靶點以及相關聯的活性成分進行匯總，采用Cytoscape 3.7.1 軟件形成“芩部丹”治療肺結核的靶點信號通路網絡。

結 果

一、“芩部丹”組方主要活性成分及靶點

在TCMSP數據庫中初步獲取黃芩、百部、丹參的生物化學成分。經過對OB、DL值篩選并剔除無對應靶標的成分后，得到黃芩活性成分32個，百部活性成分28個，丹參活性成分59個，其中有3個中藥成分為黃芩和百部共同含有的，分別為β-谷甾醇(β-sitosterol)、谷甾醇(sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，共得到“芩部丹”組方的活性成分116個。進而借助TCMSP數據庫對活性成分進行靶點預測，其中黃芩118個，百部104個，丹參134個，將三味中藥對應靶點匯總去重，并對基因名稱進行標準化處理，得到“芩部丹”組方的作用靶點共199個。

二、肺結核相關靶點的獲取與篩選

GeneCard數據庫中與肺結核相關的基因靶點共1712個，將所得靶點按得分進行排序后發現，最高值為79.963，最低值為0.163，保留大于2.712(中位數)的部分作為肺結核潛在靶點。在查找DrugBank、OMIM、TTD 數據庫后另得到部分預測靶點，將4個數據庫中獲得的靶點去掉重復部分，共得到1409個與肺結核相關的基因靶點。

三、“芩部丹”組方治療肺結核的藥物-成分-靶點網絡構建與主要成分分析

將整理得到的“芩部丹”組方與肺結核靶點取交集，從韋恩圖中可知，“芩部丹”成分與肺結核的重合靶點有82個(圖1)，表明“芩部丹”組方可能通過此82個靶點發揮治療肺結核的作用。利用 Cytoscape 3.7.1軟件構建“芩部丹”組方治療肺結核的藥物-成分-靶點網絡(圖2)。通過分析可以發現，此網絡圖中包含188個節點與612條連線，節點中包含3個中藥名稱，103個為藥物成分，82個作用靶點。

注 左側圓形代表肺結核涉及的相關靶點數量，右側圓形代表“芩部丹”組方的預測治療靶點數量，中間重疊部分代表“芩部丹”組方治療肺結核的潛在靶點數量圖1 “芩部丹”組方治療肺結核的靶點韋恩圖

注 HQ為黃芩藥物及成分；BB為百部藥物及成分；DS為丹參藥物及成分；A1(β-谷甾醇)、A2(谷甾醇)、A3(豆甾醇)為黃芩與百部的共有成分，黃色部分為作用靶點圖2 “芩部丹”組方治療肺結核的藥物-成分-靶點網絡圖

在“芩部丹”組方治療肺結核的103個藥物成分中，黃芩有30個，百部有22個，丹參有54個，其中黃芪與丹參有3個共有成分(表1)。在網絡初步構建完成后進行拓撲學參數計算，結合BC、CC、Degree 對“芩部丹”的主要有效成分進行排序，選取三者的中位數(BC=0.0008，CC=0.3979，Degree=4)為劃分標準篩選各藥物節點，結果發現三者均大于中位數的成分為41個，有10個及以上作用靶點的成分為7個，分別為木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、黃芩素(baicalein)、刺槐素(acacetin)、刺芒柄花素(formononetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羥基-9,10-二氫菲(7-methoxy-3-methyl-2,5-dihydroxy-9,10-dihydrophenan-threne)，這些成分可能是“芩部丹”組方治療肺結核的主要活性成分。

表1 “芩部丹”組方治療肺結核的活性成分及網絡標識

續表1

四、“芩部丹”組方治療肺結核的蛋白互作(PPI)網絡構建及核心靶點探索

將82個共同的靶點帶入STRING 11.0平臺中建立PPI網絡(圖3)，并運用Cytoscape 3.7.1軟件得到此網絡的拓撲學信息，BC、CC與Degree的中位數分別為0.0041、0.6231、32.5000，三者均大于中位數的基因靶點有32個，前20個靶點信息見表2。其中Degree值高于55的有10個靶點，可能為“芩部丹”治療肺結核的核心靶點。

表2 “芩部丹”組方治療肺結核的核心靶點及參數

圖3 “芩部丹”組方治療肺結核靶點的PPI網絡圖

五、“芩部丹”組方治療肺結核作用靶點的功能及通路分析

基于DAVID 6.8數據庫對“芩部丹”組方治療肺結核的82個相關靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析(P值均<0.05)，并借助在線網絡平臺進行可視化作圖處理。GO富集分析結果涉及到凋亡過程的負向調控(negative regulation of apoptotic process)、細胞增殖的正向調控(positive regulation of cell proliferation)、對藥物產生的反應(response to drug)等373個生物學過程條目(圖4)；細胞外空間(extracellular space)、細胞核(nucleus)、細胞質基質(cytosol)等39個細胞組分條目(圖5)；酶結合(enzyme binding)、同蛋白結合(identical protein binding)、血紅素結合(heme binding)等66個分子功能條目(圖6)。通過KEGG富集分析與文獻研究發現，“芩部丹”組方治療肺結核獲得108條信號通路，主要相關通路包含TNF信號通路(TNF signaling pathway；P<0.001)、細胞凋亡(apoptosis；P<0.001)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway；P<0.001)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway；P<0.001)、結核病(tuberculosis；P<0.001)，見圖7；并構建前20條主要信號通路的靶點通路網絡圖(圖8)。

圖4 “芩部丹”組方治療肺結核核心靶點的前20個生物學過程條目

圖5 “芩部丹”組方治療肺結核核心靶點的前20個細胞組分條目

圖6 “芩部丹”組方治療肺結核核心靶點的前20個分子功能條目

圖7 “芩部丹”組方治療肺結核核心靶點的前20條KEEG通路分析

討 論

中醫藥在疾病防治中具有增強臨床療效、減少不良反應等特點，一直以來都是肺結核防治中不可或缺的重要治療手段。但中藥活性成分復雜多樣，作用途徑及靶點多種多樣，通過單一的靶點與通路對中藥復方的治療機制進行闡釋是不夠全面的。

一、“芩部丹”組方的中醫認識與現代藥理研究

“芩部丹”組方的確立專為滋陰瀉火、行瘀殺蟲，主治肺結核。方中的黃芩長于清熱、燥濕，入上焦以清肺瀉火；百部為驅蟲之常用藥，擅于溫潤肺氣、降氣止咳。黃芩與百部相配伍能夠起到滋陰瀉火、潤肺止咳之功效。但肺癆日久氣血虧虛、血行不暢，導致瘀血內生，加入丹參可活血補血、涼血消癰。全方清瀉祛瘀兼以補血，選藥精煉卻作用全面。現代藥理研究也為黃芩、百部、丹參的臨床應用提供了科學依據。黃芩能夠解熱、抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調節免疫，百部可以祛痰鎮咳、殺蟲、抗菌、抗病毒等，兩者在肺熱咳嗽、哮喘、肺結核等呼吸系統病癥的治療中應用廣泛[7-8]。丹參是臨床常用的活血化瘀中藥，具有增加冠脈流量、保護血管內皮與腎功能、抗腫瘤、抗氧化等功效，是治療心腦血管疾病的重要藥物[9]。丹參還能夠抗炎，改善肺部缺氧，預防肺結核過程中的肺纖維化進展，在呼吸系統病癥中的應用也得到了越來越多的關注[10-11]。

注 圖中紅色部分為作用靶點；綠色部分為信號通路圖8 “芩部丹”組方治療肺結核的前20條靶點通路網絡圖

二、“芩部丹”組方治療肺結核的主要活性成分

雖然前期藥理機制研究表明，“芩部丹”三味中藥的單體成分(黃芩苷、對葉百部堿、丹參多酚酸鹽)能夠提高巨噬細胞表面TLR2受體的表達，可能通過調節機體免疫來發揮抗結核分枝桿菌的作用，且百部中的百部堿是能夠增強THP-1(單核細胞白血病)細胞吞噬結核分枝桿菌能力的有效抗結核成分[12-13]。本研究中藥物靶點網絡的拓撲學分析指出，黃芩苷、對葉百部堿、百部堿、丹參多酚酸鹽治療肺結核的靶點較少，雖為治療肺結核的重要明星成分，但根據本研究的結果尚不能將其列為“芩部丹”組方治療肺結核的主要活性成分。本研究在構建藥物-成分-靶點網絡圖后發現，“芩部丹”組方治療肺結核的主要活性成分有木犀草素、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羥基-9,10-二氫菲。

結核分枝桿菌侵襲機體后,多種免疫細胞被激活，釋放大量炎癥因子，導致肺部出現炎癥損傷甚至組織破壞、空洞形成。研究表明，木犀草素是一種天然黃酮類化合物，可通過多種途徑緩解炎癥反應，并能減少肥大細胞釋放白三烯，減輕急性肺損傷[14]，說明木犀草素可能具有改善肺結核患者的肺部炎癥損傷的作用。黃芩素與漢黃芩素分別為黃芩苷和漢黃芩苷在體內水解后發揮作用的有效成分，具有抗炎、抗菌、調節免疫等作用[15-16]。黃芩素結合葡萄糖醛酸形成黃芩苷，能夠調控巨噬細胞表面基因的表達，發揮抑制結核分枝桿菌生長的作用[17]。β-谷甾醇屬于植物類固醇物質，是黃芩與百部的共有成分，能夠調節外周血淋巴細胞和自然殺傷細胞的增殖與活化，減輕巨噬細胞、嗜酸性粒細胞介導的炎癥反應，并有解熱之功效，對結核分枝桿菌活性具有一定的抑制作用，是治療肺結核以及免疫介導疾病的潛在有效成分[18-19]。刺槐素可以調節肺部巨噬細胞表面基因的表達水平來對抗炎癥[20]。刺芒柄花素能夠對脂多糖導致的小鼠急性肺損傷產生保護作用，改善肺部結構的病理損傷[21]。此外，7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羥基-9,10-二氫菲是百部的重要活性成分[22]，但目前尚無有關此成分治療肺結核的報道，其治療作用有待進一步研究與挖掘。“芩部丹”組方的多個主要活性成分與結核病的病理發展過程密切相關，也在一定程度上印證了本方治療肺結核的臨床有效性。

三、“芩部丹”組方治療肺結核的核心靶點

通過成分-靶點的PPI網絡圖可以得知，“芩部丹”組方治療肺結核的核心靶點主要有TP53、IL6、AKT1、VEGFA、EGFR、PTGS2、JUN、CASP3、STAT3、TNF。TP53可調控細胞周期停滯和凋亡，結核分枝桿菌感染肺泡Ⅱ型上皮細胞的實驗研究表明，p53(TP53的表達蛋白)的表達能夠抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、Toll樣受體-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)的活化，減少炎癥因子的分泌，從而抵抗結核分枝桿菌的侵襲[23]。JUN可參與細胞凋亡、炎癥、腫瘤產生等過程，AKT1可調控細胞的增殖生長，AKT1作為c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的一個上游調控因子，能作用于JNK，使其進入細胞核活化底物c-Jun，進一步促進細胞凋亡，降低結核分枝桿菌的生存能力[24]。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是由T淋巴細胞與巨噬細胞分泌的重要促炎因子，STAT3為信號傳導與轉錄激活因子，結核分枝桿菌產生的早期分泌抗原靶蛋白6(early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)可活化巨噬細胞的STAT3，進一步刺激產生IL-6，促進炎癥反應[25]。此外，EGFR為表皮生長因子受體，研究表明肺腺癌患者中有陳舊性肺結核者的EGFR突變率明顯升高[26]。PTGS2是誘導型脂類調節物，在炎癥介質影響下能夠促進細胞凋亡，抑制血管生成[27]。CASP3 可調節腫瘤細胞的生長與增殖[28]。TNF可介導細胞的死亡、凋亡、炎癥反應等過程，并能激活其他下游炎癥因子，吸引炎癥細胞向下呼吸道聚集[29]。這些基因介導了機體炎癥反應、細胞凋亡與增殖等疾病進程，可能是“芩部丹”組方治療肺結核的重要相關靶點。

四、“芩部丹”組方治療肺結核的主要信號通路

本研究通過對篩選靶點的GO 富集分析發現，“芩部丹”組方治療肺結核的生物學功能條目較多，主要在凋亡過程的負向調控、對藥物的反應、細胞增殖的正向調控等方面。KEGG 通路富集分析的結果顯示，“芩部丹”組方在肺結核的治療中主要涉及到TNF信號通路、細胞凋亡、T細胞受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、結核病等。TNF信號通路是“芩部丹”組方與肺結核病理機制關系最為密切的通路，在調節體內炎癥、免疫反應方面發揮著重要作用。TNF作為體內的重要促炎因子主要分為兩類，TNF-α來自于活化的巨噬細胞，TNF-β來自于活化的淋巴細胞、自然殺傷細胞。相關研究指出，肺結核患者血清中的TNF-α與TNF-β水平顯著升高，可促進組織損傷，但也能使巨噬細胞進一步活化并吞噬病菌，促使肉芽腫形成，使結核分枝桿菌處于相對靜止穩定的狀態[30]。該通路中富集的TNF、IL6、CASP3、AKT1、MAPK1、JUN、PTGS2等靶點同樣是PPI分析中Degree值較高的靶點。此外，細胞凋亡也是“芩部丹”組方治療肺結核的重要信號通路。肺部組織在受到結核分枝桿菌侵犯時，細胞啟動凋亡機制，能夠把結核分枝桿菌限制在凋亡細胞內，減少了病菌從感染的巨噬細胞向外擴散，并且凋亡通路還能發揮減輕炎癥損傷的作用，是肺結核病變過程中機體的保護性過程[31]。該通路中富集的TP53、AKT1、TNF、CASP3、CYCS等靶點有較高的Degree值。調控TNF信號通路、細胞凋亡相關基因的表達可能是“芩部丹”治療肺結核的重要機制，相關功能富集及信號通路的研究也為“芩部丹”組方的后續科研探索提供了一定的參考。

網絡藥理學以系統生物學為基礎，并將藥理學、計算機科學等知識融合，可以整合TCMSP、DrugBanK等多種功能強大的化合物及疾病靶點數據庫，通過多層次的網絡構建、拓撲學分析、通路富集，對復雜疾病的病理機制進行科學解釋，并可對已知中藥或中藥復方治療疾病的作用機制進行預測。本研究借助網絡藥理學方法對“芩部丹”組方的成分和靶點，以及肺結核相關疾病靶點進行篩選與關聯，通過網絡構建、通路富集與功能挖掘，揭示了中藥組方“芩部丹”多靶點、多通路的抗肺結核作用機制，也將為“芩部丹”進一步的臨床應用與研發提供更加豐富的參考與借鑒。