蝦青素通過激活MAPK信號通路誘導睪丸生殖細胞瘤細胞凋亡和自噬

梁少奎,陽國梁,胡 慧,徐 越,肖 沛,羅梓玉,周 暢*

(1.湖南師范大學生命科學學院省部共建淡水魚類發育生物學國家重點實驗室,中國湖南 長沙 410081;2.廣西南寧市天桃實驗學校,中國廣西 南寧 530216;3.湖南財政經濟學院,中國湖南 長沙 410205)

睪丸生殖細胞瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)在人群中是一種相對罕發癌癥,但在15～35歲男性中卻是比較常見的惡性腫瘤之一[1]。目前,其治療方法主要采取手術與化療、放療相結合的方式。雖然睪丸生殖細胞瘤的治愈率很高,但患者術后患繼發性腫瘤的概率比較高,且放、化療可能會導致不育等并發癥[2～4],同時還易產生順鉑抗性等副作用[5],因此急需尋找更安全的治療手段。天然藥物提取物具有不良反應小、作用獨特、研究成本低的特點。當前,很多天然藥物提取物的抗腫瘤機制研究取得了突破性進展,并已作為抗腫瘤藥或抗腫瘤輔助藥得到廣泛的應用,例如:Li等[6]發現槲皮素可以通過上調Bax/Bcl-2比例,以及上調p53和Fas,誘導細胞凋亡;Lü等[7]在乳腺癌新輔助治療方案的回顧性研究中發現,結合紫杉醇的輔助治療具有較好的療效。

蝦青素(astaxanthin,AST)是一種從蝦蟹外殼以及藻類等海洋生物中提取的紅色天然類胡蘿卜素[8],化學名稱為 3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素,分子式為C40H52O4,具有極強的抗氧化性[9]、抗炎和抗腫瘤等多種生物學功能[10～12]。前期文獻報道,蝦青素對黑色素瘤細胞、結直腸癌細胞、口腔癌細胞等都具有生長抑制效應[13～15],但關于蝦青素對睪丸生殖細胞瘤的影響及其可能的分子調控機制目前尚未見報道。本研究以睪丸生殖細胞瘤細胞系NCCIT和NT2為研究對象,觀察蝦青素作用后,細胞的生長情況,探究蝦青素對NCCIT和NT2細胞凋亡和自噬的影響,并探討其對絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)通路的調控作用,為睪丸生殖細胞瘤防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

睪丸生殖細胞瘤細胞系NCCIT和NT2均購自上海中科院細胞庫。

蝦青素(分析對照品,UV≥98%,100 mg,批號A9692E769,購自上海Acmec公司)溶解于1,2-丙二醇(上海生工生物工程股份有限公司);胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司;PVDF膜購自美國 Millipore 公司。GAPDH、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的單克隆抗體購自英國Abcam 公司;Beclin1、LC3、p38、p-p38、細胞外信號調控的激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-ERK的抗體購自美國Cell Signal Technology公司;c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、多聚 ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;二抗goat anti-rabbit和goat anti-mouse購自北京西美杰科技有限公司。其余常規試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司。

本研究使用的儀器主要有:FACSCalibur流式細胞儀(BD公司,美國);熒光顯微鏡Axioskop 2 plus Zeiss(Zeiss公司,德國);Multiskan FC酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司,美國);Tanon 5200-Multi凝膠成像系統(上海天能科技有限公司);SXZX16熒光體式顯微鏡(OLYMPUS公司,日本)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組及處理

將NCCIT、NT2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基置于細胞培養箱(5% CO2,37℃)中培養,待細胞生長至90%左右,用0.2%胰酶消化傳代。取對數生長期NCCIT、NT2細胞,用胰酶消化離心后重懸細胞,調整細胞密度為1×105mL-1,鋪板24 h后,將其分為空白對照組和3個不同處理濃度的實驗組?？瞻讓φ战M細胞不做任何處理(預實驗顯示含丙二醇的溶劑組與不含任何試劑的空白組的實驗結果差異不明顯,故僅設一組空白組為對照組),實驗組細胞分別加入終濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmo/L的蝦青素。

1.2.2 MTT法檢測蝦青素對NCCIT、NT2細胞增殖的影響

細胞分組及處理同1.2.1。具體檢測步驟按照文獻[16]的方法,其中,將細胞接種于96孔板,同時設4個復孔,處理時間分別為24 h、48 h、72 h。用酶標儀測定每孔490 nm處的光密度值(OD值)。用如下公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=(實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.3 臺盼藍拒染法檢測蝦青素對NCCIT、NT2細胞活力的影響

具體操作按照文獻[17]的方法。實驗分空白對照組和蝦青素實驗組,蝦青素處理濃度為0.2 mmol/L,處理時間分別為24 h、48 h、72 h。用如下公式統計細胞活率:活細胞率(%)=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

1.2.4 細胞克隆形成檢測蝦青素對NCCIT細胞生長的影響

NCCIT細胞分組及處理同1.2.1。具體檢測步驟按照文獻[18]的方法,其中,細胞以1 000個/孔接種于6孔板。統計細胞克隆數(含≥50個細胞數)后用如下公式計算克隆形成率:克隆相對形成率(%)=(實驗組克隆數/空白對照組克隆數)×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色法檢測細胞形態變化

實驗分空白對照組和蝦青素實驗組,蝦青素處理濃度為0.2 mmol/L,加藥處理24 h后,按照文獻[19]的方法進行后續操作。

1.2.6 流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

細胞分組及處理同1.2.1。藥物處理24 h后,按照文獻[20]的方法進行后續操作,最后進行凋亡率的計算分析。

1.2.7 Western-blot檢測蛋白質表達

細胞分組及處理同1.2.1。加藥處理24 h后,按照文獻[20]的方法進行后續操作,檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PARP、自噬相關蛋白質Beclin1和LC3的表達水平,以及MAPK信號通路相關蛋白質(JNK、p38和ERK)及其磷酸化水平。用ImageJ軟件分析蛋白質條帶灰度值,以GAPDH為內參,計算目的蛋白的相對表達水平。

1.2.8 統計學分析

2 結果

2.1 蝦青素抑制NCCIT、NT2細胞增殖

為了檢測蝦青素對睪丸生殖細胞瘤細胞增殖的影響,采用不同濃度的蝦青素(0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L)對 NCCIT 和 NT2 細胞進行處理,通過MTT、臺盼藍拒染和細胞克隆形成實驗檢測細胞的增殖情況。MTT法檢測結果如圖1A所示,與空白對照組相比,蝦青素以劑量和時間依賴性抑制NCCIT和NT2細胞增殖。蝦青素處理 72 h時,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L 蝦青素實驗組中NCCIT細胞的存活率分別為(81.10±6.74)%、(63.77±5.27)%和(53.75±5.34)%;NT2細胞的存活率分別為(66.59±10.81)%、(42.87±9.91)%和(18.65±2.75)%,與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。臺盼藍拒染實驗結果如圖1B所示,與空白對照組相比,蝦青素(0.2 mmol/L)處理可明顯降低NCCIT、NT2細胞活性。其中,蝦青素處理72 h時,NCCIT和NT2細胞的活力分別為(60.61±3.61)%和(52.57±4.41)%,與空白對照組比較均有顯著差異(P<0.01)。MTT和臺盼藍拒染實驗結果均提示,NCCIT細胞較NT2細胞對蝦青素的耐受性更強。因此,我們用NCCIT細胞進行細胞克隆形成實驗,結果如圖1C所示:隨著蝦青素處理濃度增加,細胞克隆形成能力降低,且與空白對照組比較,實驗組的克隆形成率差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

圖1 蝦青素抑制NCCIT、NT2細胞增殖(A)不同濃度的蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細胞24 h、48 h、72 h后,MTT法檢測細胞增殖率;(B)0.2 mmol/L蝦青素處理NCCIT和NT2細胞24 h、48 h、72 h時,臺盼藍拒染法檢測細胞活性;(C)不同濃度的蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT細胞7～10 d,再用結晶紫染色檢測克隆形成數目。數據以3組獨立實驗得到的平均值±標準差表示;與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;兩組間比較采用t檢驗。圖2～4的統計分析同此圖。Fig.1 Astaxanthin inhibits proliferation in NCCIT and NT2 cells(A)Cell proliferation rates detected by MTT assay after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h,48 h and 72 h;(B)Cell activities measured by trypan blue dye exclusion after treatment with 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h,48 h and 72 h;(C)Clonogenic growth of NCCIT cells treated with astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 7 to 10 days and stained by crystal violet.Data represent the mean±SD from three separate experiments.*P<0.05 and**P<0.01,compared with control group.Comparison between two groups was performed by t-test.The statistical analysis of the Figs.2～4 is the same as this one.

2.2 蝦青素誘導NCCIT、NT2細胞凋亡

0.2 mmol/L蝦青素處理24 h后,NCCIT和NT2細胞的形態觀察結果如圖2A所示,空白對照組細胞形態、大小均正常,蝦青素處理組中,NCCIT和NT2均出現細胞體積變小、細胞核熒光強度增高、核固縮等細胞凋亡現象。為量化凋亡比例,使用流式細胞儀檢測凋亡率,結果如圖2B所示,隨著蝦青素處理濃度加大,細胞總凋亡率呈遞增趨勢。在NCCIT細胞中,空白對照組的總凋亡率為(3.82±0.51)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L蝦青素處理組的總凋亡率分別為(4.98±0.45)%、(8.36±0.65)%、(16.58±2.32)%;在 NT2細胞中,空白對照組的總凋亡率為(8.14±1.32)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L蝦青素處理組的總凋亡率分別為(15.52±2.62)%、(19.31±0.37)%、(23.43±5.10)%,兩個細胞組的結果平行性好,與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。進一步采用Western-blot檢測凋亡相關蛋白質的表達水平,結果如圖2C所示,蝦青素處理組與空白對照組相比,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和 cleaved PARP的表達水平升高。以上細胞水平和分子水平實驗均表明,蝦青素能誘導NCCIT、NT2細胞凋亡。

圖2 蝦青素誘導NCCIT、NT2細胞凋亡(A)0.2 mmol/L蝦青素處理NCCIT和NT2細胞24 h后,將細胞固定并用Hoechst33258染色,熒光顯微鏡下觀察細胞形態;(B)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI染色,用流式細胞儀分析細胞凋亡率;(C)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細胞24 h后,采用Western-blot檢測凋亡相關蛋白質的表達水平。Fig.2 Astaxanthin induces apoptosis in NCCIT and NT2 cells(A)Morphology of apoptotic cell nuclei under a fluorescent microscope after cells were exposed to 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h and then stained with Hoechst33258;(B)Apoptosis rates analyzed by flow cytometry after cells were treated with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h and stained with Annexin V-FITC/PI;(C)Expression of apoptosis related proteins in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

2.3 蝦青素誘導NCCIT、NT2細胞自噬

細胞自噬是細胞程序性死亡方式之一,對維持內環境穩態具有重要作用[21]。Beclin1與自噬體的成熟相關,LC3Ⅱ的表達與自噬小泡發生相關,反映自噬的發生發展程度。蝦青素處理細胞24 h后,采用Western-blot檢測細胞中自噬相關LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表達,結果如圖3A所示,LC3的激活體LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表達水平隨蝦青素處理濃度增加而升高,提示蝦青素可能誘導NCCIT和NT2細胞發生自噬。

圖3 蝦青素誘導NCCIT、NT2細胞自噬(A)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細胞24 h后,采用Western-blot檢測自噬相關蛋白質Beclin1和LC3的表達水平;(B)用CQ(1 μmol/L)預處理NCCIT和NT2細胞0.5 h,之后聯合蝦青素(0.2 mmol/L)共同處理24 h,采用Western-blot檢測Beclin1和LC3蛋白的表達水平。Fig.3 Astaxanthin induces autophagy in NCCIT and NT2 cells(A)Expression of Beclin1 and LC3 in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h;(B)Expression of Beclin1 and LC3 analyzed by Western-blot after cells were pretreated with CQ(1 μmol/L)for 0.5 h,and co-incubated with astaxanthin(0.2 mmol/L)for another 24 h.

為明確蝦青素誘導LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達的升高是通過增加自噬體的生成還是抑制自噬體的降解,應用抑制自噬體降解的自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)進行處理。結果如圖3B所示,CQ處理促進了蝦青素(0.2 mmol/L)誘導的Beclin1表達增加,并顯著增加蝦青素誘導的LC3Ⅱ表達上調(P<0.01)。以上數據表明,蝦青素可誘導NCCIT和NT2細胞發生自噬,且這種作用是通過增強自噬活性使自噬體形成增多實現的,而不是通過抑制自噬體的降解實現的。

2.4 蝦青素激活NCCIT、NT2細胞中MAPK信號通路

許多研究證實MAPK信號通路在調節腫瘤細胞生長發育、分化和死亡等生物學過程中具有重要作用[22～23]。本研究通過檢測MAPK信號通路中3個主要成員的表達,考察蝦青素誘導NCCIT、NT2細胞凋亡和自噬的可能機制。結果如圖4所示,與空白對照組相比,蝦青素處理組中JNK、p38和ERK的磷酸化水平升高,而JNK、p38和ERK蛋白的相對表達水平無明顯差異,表明蝦青素可以激活NCCIT、NT2細胞中的MAPK信號通路。

圖4 蝦青素激活NCCIT、NT2細胞中的MAPK信號通路不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細胞24 h后,采用Western-blot檢測JNK/p-JNK、p38/p-p38、ERK/p-ERK蛋白的表達水平。Fig.4 Astaxanthin activates MAPK signaling pathway in NCCIT and NT2 cellsExpressions of JNK/p-JNK,p38/p-p38,ERK/p-ERK in cells were analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

3 討論

傳統中藥中的活性成分日益受到關注。但是,傳統中藥成分中大多數活性小分子化合物的藥理機制仍不明確,這極大地限制了中藥資源的開發利用。因此,利用分子生物學及細胞生物學的研究手段,深入探究天然藥物中提取的高活性小分子化合物的抗腫瘤機制是中藥現代化開發利用的必需手段。

蝦青素已被證明具有強抗氧化性,以及抗腫瘤、抗炎和免疫抑制等多種功能,具有廣闊的應用前景。Yasui等[14]的研究結果表明,蝦青素可以通過NF-κB信號通路抑制葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導的炎癥反應,減輕偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和DSS誘導的結腸增生性病變,并減少結腸炎相關性結直腸癌的發生。Kavitha等[24]利用7,12-二甲基苯并(a)蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)誘發倉鼠頰袋腫瘤,并在倉鼠右側頰袋涂0.5% DMBA誘導腫瘤發生的同時,按照15 mg/kg的劑量在其飼料中添加蝦青素進行干預,發現蝦青素可以預防腫瘤的產生,其保護作用可能與其激活Nrf2/Keap-1信號通路有關。蝦青素在預防腫瘤發生和癌癥治療方面有很好的潛能[10],但是,蝦青素抗腫瘤的詳細分子機制目前仍未完全闡明。

本研究首先通過繪制細胞生長曲線檢測了蝦青素對睪丸生殖細胞瘤細胞增殖的影響。結果顯示,蝦青素對兩種細胞增殖有著顯著的抑制作用,且這種抑制作用在其濃度低至0.1 mmol/L時依然存在(圖1A)。克隆形成實驗結果確認,蝦青素能抑制NCCIT細胞的存活能力(圖1C),0.3 mmol/L蝦青素處理組的克隆數與對照組比較下降50%。進一步的細胞形態觀察結果顯示,0.2 mmol/L的蝦青素處理NCCIT、NT2細胞24 h后,細胞形態發生皺縮,甚至變圓脫落,細胞密度顯著下降(圖2A)。流式細胞術檢測結果顯示,不同濃度蝦青素處理NCCIT、NT2細胞后,細胞凋亡率呈劑量依賴性增高(圖2B)。細胞凋亡主要通過caspase通路的級聯反應啟動。正常情況下,caspase蛋白及PARP以無活性的前體形式存在,當細胞凋亡發生時其會被上一級caspase蛋白切割而活化。因此,caspase和PARP的切割情況可以用來判斷細胞是否發生凋亡。本研究發現,用蝦青素處理細胞,尤其是高濃度(0.2 mmol/L和0.3 mmol/L)處理時,caspase-3及PARP均能檢測到明顯的切割條帶。同時,蝦青素處理組細胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2顯著下調,而促凋亡蛋白Bax顯著上調。Bax通過與線粒體膜結合,形成滲透性膜轉移孔復合物,建立線粒體膜通道,介導促凋亡分子細胞色素C和Smac/Diablo等的釋放,從而激活caspase級聯反應,并通過caspase-3激活破壞基因組DNA的核酸內切酶,造成基因組DNA裂解,同時失活DNA修復相關酶,造成DNA修復能力降低,在此基礎上進一步分解細胞骨架,引起一系列凋亡執行過程的發生。本文研究結果顯示,蝦青素可以顯著提高Bax/Bcl-2的比值,從而促進腫瘤細胞凋亡。該結果與Hormozi等[25]研究蝦青素誘導人大腸癌細胞株LS-180細胞凋亡的結果一致。

小分子抗腫瘤藥物的細胞毒性一般體現為誘導細胞凋亡、壞死及自噬性死亡。自噬既是細胞的一種自我保護機制,也是一種與凋亡并列的程序性死亡機制。Beclin1是哺乳動物中Atg6的同源蛋白質,是酵母ATG6/Vps30在哺乳動物中的同源物,是介導其他自噬蛋白定位于前自噬泡的關鍵因子。人類的Beclin1基因位于染色體17q21,其編碼產物是啟動自噬過程的標志和調節自噬現象的關鍵蛋白質。Beclin1包含4個重要的結構域,其中包括Bcl-2結合結構域(Bcl-2 homology domains,BH3)。Beclin1作為一種自噬調節因子,同Bcl-2解離的過程可能有兩種機制。一是通過BOP蛋白(BH3-only protein)競爭性結合Bcl-2,使二者解離;二是JNK-1磷酸化Bcl-2的多個絲氨酸蘇氨酸位點,磷酸化后的Bcl-2蛋白與Beclin1蛋白的結合能力大大減弱,從而分離,分離后的Beclin1與PI3KⅢ/Vps34的相互作用加強,刺激自噬的發生[26]。因此,我們進一步檢測蝦青素是否影響自噬體形成的標志蛋白質LC3Ⅱ和Beclin1表達。Western-blot結果顯示,Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白的表達水平隨蝦青素處理濃度的升高而增高,并且在聯合自噬抑制劑CQ處理后,兩種蛋白質的表達水平較蝦青素單獨處理時顯著增加,這表明蝦青素誘導睪丸生殖細胞瘤細胞發生自噬。蝦青素調控Beclin1和Bcl-2蛋白復合物,誘導細胞凋亡和自噬。

細胞凋亡和自噬的發生受多條信號通路和多種調節因子的作用,MAPK信號通路是主要信號通路之一。MAPK級聯激活是多種信號通路的中心,MAPK通路的主要作用是接收膜受體并轉換與傳遞相關信號至細胞核。MAPK信號通路有3個主要家族成員:JNK、p38和ERK?；罨腏NK和p38可通過調控與凋亡相關轉錄因子間接或直接調節Bax、Bcl-2和caspase蛋白,促進細胞凋亡[27～28]。本文的研究結果顯示,與空白對照組比較,隨著蝦青素處理濃度的增加,JNK與p38蛋白的表達水平無顯著變化,而p-JNK和p-p38蛋白的表達水平上調,這提示蝦青素是通過激活JNK和p38調控凋亡相關蛋白質,從而誘導細胞凋亡。此外,隨著蝦青素處理濃度的增加,ERK蛋白的表達水平也無顯著變化,而p-ERK、剪切的PARP以及Beclin1和LC3Ⅱ的表達水平增加,提示蝦青素促進NCCIT、NT2細胞內ERK的磷酸化,可能激活ERK/MAPK通路,活化caspase-3,進而剪切PARP,促進細胞凋亡,同時上調自噬相關蛋白質LC3Ⅱ和Beclin1的表達,從而誘導細胞自噬。

綜上所述,本研究的實驗結果證實,蝦青素通過激活MAPK信號通路誘導睪丸生殖細胞瘤細胞凋亡和自噬。下一步,我們將建立動物實驗模型,研究蝦青素與低毒性自噬抑制劑聯合使用的效果,為蝦青素抗腫瘤功效的后期開發利用奠定堅實的理論基礎。