沙蟲總蛋白提取及酶解條件優化*

黃翠燕，余凱健，廖燕玲，高炳淼

(1 海南醫學院第一附屬醫院藥學部，海南 海口 570102；2 海南醫學院熱帶轉化醫學教育部重點實驗室藥學院，海南 海口 571199)

沙蟲，又稱方星格蟲(Sipunculusnudus)，隸屬于星蟲動物門，方格星蟲綱。全身由吻與軀干兩部分組成，呈圓筒狀，全身光裸，體壁厚，縱橫肌層均分割為肌束，呈帶狀以致使體表出現方格狀。沙蟲廣泛分布于大西洋、太平洋、印度洋、地中海、紅海和加勒比海等海域。全世界共有11種，其中我國有5種，主要分布于東南沿海[1-5]。沙蟲具有豐富的營養物質，民間稱其為“海洋冬蟲夏草”“動物人參”，古籍中記載沙蟲具有性寒、味甘，具有滋陰補陽、清肺降火、活血保健等功效,可用于抗氧化、抗病毒活性、抗疲勞、提高免疫力及促進傷口愈合等[6-12]。

近年來，通過實驗研究發現，沙蟲蛋白質經酶促水解后產生具有抗氧化、調節人體機能的生物活性小肽，能夠通過清除體內自由基而成為副作用小且易于吸收的天然抗氧化劑[13-18]。本實驗采用沙蟲為實驗材料，采用水提法提取沙蟲總蛋白，對沙蟲酶解多肽的制備工藝進行優化，通過DPPH·自由基清除的實驗驗證其抗氧化活性，以期為沙蟲的進一步開發利用奠定基礎。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

沙蟲采集于海南省儋州市光村鎮，其形似長筒，如腸子一般，體長約12～19 cm；中性蛋白酶(Dispase S10013)、木瓜蛋白酶(Papain YY10509)、胃蛋白酶(S10027)，上海源葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶(01-186)，北京奧博星有限公司；蛋白 Marker，江蘇楚瑞生物科技有限公司；BCA法蛋白含量測定試劑盒(BL521A)、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒，白鯊生物科技有限公司；RIPA裂解液、PMSF溶液，北京普利來基因技術有限公司；DPPH·自由基清除能力試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器及設備

FW100型高速粉碎機，北京市永光明醫療儀器廠；DYCZ-24DH型垂直蛋白電泳儀，北京六一生物科技有限公司；SynergyHTX多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;FD-A10N冷凍真空干燥機，冠森生物科技上海公司；Tanon 6600全自動化學發光圖像分析系統，上海天能科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 總蛋白的提取

取新鮮沙蟲，解剖后清洗去泥沙，排列于托盤，50 ℃干燥24 h后，粉碎至粉末，裝入密封袋于冰箱冷藏保存。取2 g粉末溶于60 mL去離子水中超聲處理后加500 μL裂解液和5 μL PMSF攪拌使充分混勻，放至4 ℃冰箱24 h，離心取上清液，冷凍干燥成粉，保存至-20 ℃冰箱備用。

2.2 總蛋白濃度測定及SDS-PAGE分析

配制BSA標準品和待測樣品，加入96孔板內，在每孔加入BCA工作液，37 ℃反應30 min，在562 nm處測吸光度，測定總蛋白含量。取10 μL 2×Loading Buffer緩沖液與10 μL總蛋白提取物混合均勻，放置于水浴鍋中100 ℃煮沸5 min，1000 r/min離心3 min后取上清液，電泳約3.5 h后，R-250染色液染色過夜，再進行脫色，脫至底膠藍色消失后用凝膠成像系統掃描照相并記錄電泳的結果。

2.3 酶種類對總蛋白水解度的影響

稱取沙蟲總蛋白凍干粉若干份，在一定加酶量的條件下，分別制備木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解液，分析并比較水解效果的優劣。制備條件見表1。

表1 四種蛋白酶活性的最適條件Table 1 The optimum conditions for the activity of four proteases

2.4 單因素實驗

2.4.1 pH對沙蟲蛋白水解度的影響

分別稱取沙蟲蛋白凍干粉0.1 g，稱取0.5 mg酶為底物，在料液比為1:20的條件下，探究pH條件為5～9，50 ℃酶解4 h后，10000 r/min離心3 min后，取上清液過濾，使用BCA法測定其吸光度，計算出多肽含量及水解度。

在圖3中，固定f=0.2,可以清楚看到，ER網絡在HTLDD、LTHDD和RDD策略下具有相似的魯棒性，表明不同的邊定向策略對ER網絡抵制級聯故障的魯棒性影響不大.

2.4.2 溫度對沙蟲蛋白水解度的影響

在pH為7的條件下，其他實驗步驟與2.4.1一致，探究酶解溫度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，測定多肽含量及水解度。

2.4.3 時間對沙蟲蛋白水解度的影響

在pH為7，酶解溫度50 ℃下，其他實驗步驟與2.4.2一致，探究酶解時間為2～6 h時，測定多肽含量及水解度。

2.4.4 E/S對沙蟲蛋白水解度的影響

在pH為7，酶解溫度50 ℃，酶解時間為3 h的條件下，探究E/S為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和12%時，測定多肽含量及水解度。

2.5 正交實驗優化

基于上述單因素實驗，選擇酶解pH(A)、溫度(B)、時間(C)、加酶量(D)四個因素，每四個因素做三個水平，以蛋白水解率作為指標，進行正交實驗探究中性蛋白酶酶解沙蟲總蛋白的最佳水解條件。如表2所示設計正交實驗。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal test

2.6 清除自由基實驗[19]

DPPH工作液粉劑加入40 mL無水乙醇制備后避光保存，分別取400 μL樣品和600 μL工作液混勻避光反應30 min，4000 r/min離心5 min后，在波長為517 nm測定吸光度值。空白組以80%的甲醇溶液代替樣品，設三個平行組。以不同濃度梯度(50 mg/mL、40 mg/mL、30 mg/mL、20 mg/mL和10 mg/mL)的酶解多肽探究DPPH·清除率與酶解多肽濃度的關系。

3 結果與分析

3.1 沙蟲總蛋白提取及含量測定

圖1 沙蟲總蛋白的電泳分析Fig.1 Electrophoretic analysis of total protein of Sipunculus nudus

3.2 蛋白酶種類對沙蟲總蛋白酶解的影響

通過SDS-PAGE電泳及BCA法測定胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物的水解度，以測定酶的活性。電泳結果表明殺蟲總蛋均能被四種蛋白酶酶解，無顯示明顯的差異。再通過BCA法測定，結果如表3所示，中性蛋白酶的酶解能力最強，其次是堿蛋白酶。因此，選用中性蛋白酶進行單因素實驗及正交實驗。

表3 四種不同蛋白酶對沙蟲總蛋白的水解效果Table 3 Hydrolysis of Sipunculus nudus total protein by four different proteases

3.3 單因素實驗條件優化

3.3.1 pH對沙蟲蛋白水解度的影響

實驗探究了酶解pH從5.0～9.0之間蛋白水解度的情況。在pH 5.0～9.0之間，蛋白水解度先上升后下降，當pH為6時，沙蟲蛋白水解度達到最高值，因此，最佳酶解pH為6。隨著pH增大，酶的活性受到影響，水解度明顯下降(如圖2所示)。

圖2 pH對沙蟲總蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis of total protein of Sipunculus nudus

3.3.2 酶解溫度對沙蟲總蛋白水解度的影響

實驗在其他條件相同時，探究酶解溫度在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃時，蛋白水解度的情況。沙蟲蛋白水解度首先迅速上升后緩慢降低，整體變化幅度大，當酶解溫度達到45 ℃時，沙蟲蛋白水解度達到最大，如圖3所示。因此，最佳酶解溫度為45 ℃。

圖3 酶解溫度對沙蟲總蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree of total protein of Sipunculus nudus

3.3.3 酶解時間對沙蟲蛋白水解度的影響

實驗在其他條件相同時，探究酶解時間從2.0～6.0 h之間，沙蟲蛋白水解度的情況，2.0～5.0 h之間，蛋白水解度在不斷的升高，但在酶解時間達到4 h時，蛋白水解度達到最高。之后隨著酶解時間增加開始降低。可能隨著時間的延長，酶解蛋白受到一些因素影響，水解度下降，如圖4所示，胃蛋白酶的最佳酶解時間為4 h。

圖4 酶解時間對沙蟲總蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree oftotal protein of Sipunculus nudus

3.3.4 加酶量對沙蟲蛋白水解度的影響

實驗在其他條件相同時，探究E/S在4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和12%時，沙蟲酶解蛋白水解度的情況。如圖5所示，酶解蛋白的水解度隨著加酶量的增加呈現先增后減的趨勢，當E/S為4%時，沙蟲蛋白水解度達到最大值，繼續增加酶量，水解度反而下降。實驗結果為正交試驗提供了酶與底物比例的參考范圍。

圖5 加酶量對沙蟲總蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of total protein of Sipunculus nudus

3.4 正交試驗優化結果

選用胃蛋白酶，在pH為5、6和7、酶解溫度為45 ℃、50 ℃和55 ℃，酶解時間為3 h、4 h和5 h、E/S(%)為7%、8%和9%的條件下，進行正交實驗，結果如下表4所示，最佳水平的組合為A1B2C2D2，即中性蛋白酶酶解沙蟲總蛋白的最適條件為：pH為5，E/S為8%，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為4 h。在最佳酶解條件下，沙蟲蛋白的水解度達到了86.1%。

表4 正交試驗結果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test

續表4

3.5 DPPH·自由基清除實驗結果

DPPH·自由基試劑與乙醇溶液混合后呈現成紫色，在波長為517 nm處有特征吸收峰，可用于驗證抗氧能力[20]。如圖6所示，酶解樣品的清除率均比未酶解樣品高，其最高值為6號樣品，清除率達到44.64%，其酶解條件為pH為6、E/S為8%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為4 h。通過大量制備實驗發現，沙蟲的清除能力與沙蟲蛋白濃度成正相關，隨著沙蟲樣品濃度的不斷增大(如圖7所示)，DPPH·自由基清除率增大。

圖6 沙蟲樣品對DPPH的清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of Sipunculus nudus samples

圖7 不同濃度梯度樣品對DPPH·自由基清除的效果Fig.7 DPPH · radical scavenging ability of samples with different concentrations

4 結 論

海洋生物沙蟲除了食用的風味獨特之外，具有抗氧化、抗病毒活性等多種藥理活性[21-22]。本研究以沙蟲為原料，采用加裂解液法提取沙蟲總蛋白，通過中性蛋白酶酶解沙蟲總蛋白，以其蛋白水解度及DPPH·自由基清除率為指標，對酶解條件進行單因素實驗和正交實驗，得到最佳酶解條件為：pH為5，E/S為8%，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為4 h。清除自由基活性實驗結果表明，沙蟲酶解多肽的濃度越高，DPPH·自由基清除率效果越好。本研究表明采用優化的酶解工藝條件制備的沙蟲酶解多肽具有顯著的清除自由基活性，為沙蟲酶解多肽的大規模生產及開發應用提供理論依據。