龍眼葉中總黃酮的提取及降血糖機(jī)制的研究*

黃淑婷，巫秋霖，莫漫莉，張李江，王華鳴，姜 濤

(珠海科技學(xué)院藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519041)

糖尿病在我們生活當(dāng)中并不少見(jiàn)，出現(xiàn)糖尿病這種病癥總結(jié)來(lái)主要是因?yàn)轶w內(nèi)的免疫系統(tǒng)功能受到了外部致病因子的侵害，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損。同時(shí)在外界存在的微生物感染和遺傳因素等，都會(huì)給身體健康帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。體內(nèi)的胰島細(xì)胞功能在這些風(fēng)險(xiǎn)因素的影響下出現(xiàn)衰退，胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率進(jìn)一步下降，具體的癥狀就是體內(nèi)的血糖數(shù)值增加。

根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制身體內(nèi)消化道生成的α-葡萄糖苷酶的活性，可以控制人體吸收糖類的數(shù)量，這樣就達(dá)到降低血糖的目的[1]。阿卡波糖、伏格列波糖以及米格列醇等都是當(dāng)前臨床上經(jīng)常使用到的α-葡萄糖苷酶抑制劑(AGI)，他們具有控制“多糖分解成單糖”這一過(guò)程的能力是因?yàn)樗麄兡軌蛴行д碱I(lǐng)α-葡萄糖苷酶與糖的結(jié)合位點(diǎn)，從而避免人體過(guò)量吸收單糖，這一作用有助于糖尿病患者的血糖數(shù)值恢復(fù)正常。AGI的優(yōu)點(diǎn)是吸收少，不會(huì)產(chǎn)生全身性的嚴(yán)重副作用，僅有可能因未消化的糖類被細(xì)菌反應(yīng)而引起腹脹、腹瀉和腹痛[2-3]。但是現(xiàn)今的研究主要集中在篩選具有廣譜作用的抗糖尿病藥物，對(duì)新型降血糖藥物的研發(fā)的關(guān)注較少，因而需要進(jìn)一步研究與發(fā)展副作用小，同時(shí)療效更佳具有更有療效的新型AGI。

通常情況下，龍眼葉(DimocarpusLonganLour.)的制作選取龍眼樹(shù)當(dāng)中最嫩的樹(shù)葉部位，龍眼葉的功效為去除邪熱或虛熱解除病毒，疏解肌表促使發(fā)汗等為主要功效。近年來(lái)隨著科學(xué)實(shí)驗(yàn)的深入分析，人們?cè)邶堁廴~當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了更多的化學(xué)成分，比如多酚類、黃酮類以及揮發(fā)油物質(zhì)[4-5]。其中黃酮類化合物為其主要活性物質(zhì)，在這些物質(zhì)當(dāng)中，只有黃酮類的化合物可以產(chǎn)生抗氧化的作用，對(duì)冠狀血管類的疾病具有良好的療效，具有強(qiáng)化血管，抑制病毒和細(xì)菌的作用[6]。并且在這些實(shí)驗(yàn)當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)了黃酮類物質(zhì)可以有效的減少血糖的活躍度[7]。但是這些研究大多只停留在成分提取研究這一層面，為了更好地充分合理利用龍眼葉藥材資源，因此有必要深入研究龍眼葉，闡明其降低血糖的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

龍眼葉購(gòu)置廣東省茂名市信宜區(qū)龍眼葉種植基地。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC>98%)，上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，99%)，上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(50 U·mg-1)，上海源葉生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(pH 6.8，0.1 mol·L-1)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿卡波糖(56180-94-0BR型，95%)，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水三氯化鋁，無(wú)水碳酸鈉，無(wú)水乙醇等分析純，實(shí)驗(yàn)所用蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AR224C型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；LDZF-50KB-Ⅲ型立式壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠；GZX-9240MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，基因有限公司。

1.3 波長(zhǎng)的選擇

首先將蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品溶液調(diào)配至適應(yīng)的濃度，濃度配比設(shè)定為0.2 mg·mL-1；選定的劑量為1 mL，將標(biāo)準(zhǔn)溶液置于選作為容器的25 mL容量瓶中。然后配制濃度控制為1.5%的AlCl3溶液，再取5 mL配制好的AlCl3溶液混入容量瓶當(dāng)中搖晃均勻。完成上述步驟后再按照60%的濃度標(biāo)準(zhǔn)配制乙醇混合液，再次將60%乙醇緩慢加入容量瓶當(dāng)中，滴定到刻度線后充分混合。將空白對(duì)照組設(shè)定為60%乙醇，使用紫外分光光度計(jì)展開(kāi)掃描，波長(zhǎng)數(shù)值控制在200～700 nm。重復(fù)5次上述實(shí)驗(yàn)步驟，測(cè)得本實(shí)驗(yàn)的最適波長(zhǎng)為417 nm，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，分別吸取0.2 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL放入到6個(gè)規(guī)格為25 mL的容量瓶當(dāng)中，再配制濃度控制為1.5%的AlCl3溶液，分別取5 mL配制好的AlCl3溶液混合到這6個(gè)容量瓶中。均勻的晃動(dòng)后用60%乙醇溶液定容至刻度線，獲得本實(shí)驗(yàn)的蘆丁對(duì)照品。然后把60%乙醇作為空白的對(duì)照組，最后選擇417 nm的波長(zhǎng)展開(kāi)對(duì)照品溶液的吸光度測(cè)試[8]。將實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度(A)設(shè)為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品濃度(mg·mL-1)設(shè)為橫坐標(biāo)。

1.5 龍眼葉總黃酮的提取

取新鮮龍眼葉，洗干凈之后，然后在50 ℃的環(huán)境下進(jìn)行烘干處理，經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，得到龍眼葉粉末。然后對(duì)龍眼葉中的總黃酮進(jìn)行提取，具體的操作流程如下：提前選取6 g處理好的龍眼葉粉末，按照95%的濃度標(biāo)準(zhǔn)配置乙醇溶液，在龍眼葉粉末中加入80 mL配制好的95%乙醇溶液，使用超聲波設(shè)備進(jìn)行提取，時(shí)間持續(xù)2.5 h，最后使用抽濾裝置進(jìn)行抽濾。得到的殘?jiān)镔|(zhì)再次加入配制好80 mL的95%乙醇溶液，再次進(jìn)行超聲波提取和抽濾。經(jīng)過(guò)兩次提取后保留抽濾后的濾液，再通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)乙醇物質(zhì)進(jìn)行減壓回收，由此得到龍眼葉中的總黃酮，將其置于錐形瓶中冷藏儲(chǔ)存[9]。

1.6 總黃酮的含量測(cè)定

吸取5 mL的樣品備用，然后挑選規(guī)格為25 mL的容量瓶，將樣品直接放入到容量瓶中。另外再配制濃度控制在1.5%的AlCl3溶液，使用移液槍吸取5 mL并混合到容器當(dāng)中將其搖勻。完成以上步驟后添加60%乙醇溶液至容器中，將其定容到刻度線并搖勻。最后以60%乙醇為空白對(duì)照組，將混合溶液穩(wěn)定放置30 min后，在417 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

樣品中總黃酮的含量(mg·g-1)=(Y×V1)/(m×V)

式中：Y為從回歸方程求得蘆丁量，mg；V1為樣品溶液總體積，100 mL；V為測(cè)定時(shí)取樣體積，5 mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.7 龍眼葉總黃酮的降血糖活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)設(shè)定幾個(gè)不同條件的組別進(jìn)行，分為樣品組、背景組、空白組、體系空白組。背景組用以消除待測(cè)樣品溶液產(chǎn)生的吸光值誤差，體系空白組用以消除待測(cè)樣品溶液本身帶來(lái)的顏色誤差。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行降血糖活性測(cè)定，具體的操作流程如下：在96孔板中，依次按照不同組別的要求加入表1所示的各種試劑，用設(shè)定的5個(gè)不同濃度待測(cè)樣品分別進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗(yàn)，待測(cè)試劑加入完畢后，將96孔板放入水浴鍋中，反應(yīng)溫度設(shè)定為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為15 min。再對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別添加對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，容量控制在10 μL，反應(yīng)溫度設(shè)定為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30 min。然后再加入0.1 mol·L-1Na2CO3溶液100 μL終止實(shí)驗(yàn)[10]。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)反應(yīng)組的吸光度A，測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定為405 nm，用下方公式[11]分別計(jì)算各個(gè)濃度的待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率。每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，最終抑制率取三孔平均值。

陽(yáng)性對(duì)照藥品為市面上出售的降血糖藥物阿卡波糖。

分別將實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果繪制折線關(guān)系圖，將不同濃度待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率設(shè)為縱坐標(biāo)，待測(cè)樣品的濃度設(shè)為橫坐標(biāo)，對(duì)比并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 實(shí)驗(yàn)分組所加試劑及試劑用量Table 1 Reagents added and reagent dosage in experimental grouping (μL)

2 結(jié)果與討論

2.1 龍眼葉總黃酮的含量測(cè)定

按1.5方法提取龍眼葉中的總黃酮，并用1.6方法對(duì)龍眼葉總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)測(cè)定和計(jì)算得知原樣品中總黃酮的濃度為0.11403 mg·mL-1，樣品中總黃酮含量為0.3753 mg·g-1。

2.2 龍眼葉總黃酮降血糖活性測(cè)定

2.2.1 龍眼葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力

按1.7方法對(duì)0.15、0.2、0.25、0.3和0.35 mg·mL-1龍眼葉總黃酮的酶活性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度使用3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行相應(yīng)的平行實(shí)驗(yàn)，將測(cè)得的吸光度來(lái)計(jì)算其SD值和平均值。可以從圖1當(dāng)中看出龍眼葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果，在五個(gè)不同濃度的條件下得出的抑制率數(shù)值分別為：49.7%±2.7%、55.62%±2.66%、65.09%±2.69%、69.23%±2.23%和72.37%±2.11%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，隨著龍眼葉總黃酮濃度的升高，對(duì)酶活性的抑制效果也隨之升高，呈現(xiàn)出明顯的量效依賴關(guān)系。而當(dāng)濃度降低至0.15 mg·mL-1時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率約為49%，因此龍眼葉總黃酮在一定程度下會(huì)具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

圖1 龍眼葉總黃酮濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率關(guān)系圖Fig.1 Relationship between total flavonoid concentration in longan leaves and α-glucosidase inhibition rate

2.2.2 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力

圖2 阿卡波糖濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率關(guān)系圖Fig.2 Relationship between Akapoose concentration and α-glucosidase inhibition rate

按1.7的方法對(duì)0.01、0.05、0.1、0.3和0.5 μg·mL-1阿卡波糖的酶活性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度使用3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行相應(yīng)的平行實(shí)驗(yàn)，將測(cè)得的吸光度來(lái)計(jì)算其SD值和平均值。可以從圖2當(dāng)中看出阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果，在五個(gè)不同濃度的條件下得出的抑制率數(shù)值分別為：21.89%±2.18%、26.63%±2.90%、55.03%±4.38%、66.86%±2.94%和69.23%±3.14%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知在0.3 μg·mL-1的阿卡波糖溶液和0.25 mg·mL-1龍眼葉總黃酮測(cè)出的抑制率一致，說(shuō)明在此濃度時(shí)，龍眼葉總黃酮的降血糖能力與阿卡波糖的降血糖能力相近。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，龍眼葉總黃酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的能力，雖然與陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖相比，其抑制酶活性的能力較弱，但是該實(shí)驗(yàn)結(jié)論為提取純化龍眼葉中的總黃酮用以開(kāi)發(fā)新的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物提供了新的思路，可作為未來(lái)動(dòng)物體內(nèi)降血糖研究的實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用超聲波法提取龍眼葉總黃酮，選擇蘆丁作為實(shí)驗(yàn)中總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制出對(duì)應(yīng)的曲線關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)當(dāng)前龍眼葉總黃酮的吸光數(shù)值展開(kāi)測(cè)量。通過(guò)計(jì)算得出，龍眼葉總黃酮含量為0.3753 mg·g-1。在進(jìn)行多組平行試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，測(cè)得龍眼葉總黃酮濃度區(qū)間在0.15～0.35 mg·mL-1時(shí)，總黃酮濃度越高，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率越高，從而得知濃度和抑制作用呈正相關(guān)，并且0.25 mg·mL-1的龍眼葉總黃酮與0.3 μg·mL-1阿卡波糖溶液的抑制率一致。

本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是：龍眼葉可提取出總黃酮，并且龍眼葉總黃酮具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。這項(xiàng)結(jié)論為未來(lái)研究降血糖的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)雖然沒(méi)有對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以篩選出總黃酮含量高、酶抑制活性強(qiáng)的提取工藝，但是本實(shí)驗(yàn)顯示出龍眼葉具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，揭示了龍眼葉總黃酮具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。進(jìn)一步深入研究龍眼葉的作用前，除了研究最佳提取工藝以外，還可再增加純化的步驟，也許會(huì)對(duì)降血糖的效果有更明顯的體現(xiàn)。相信隨著科技的進(jìn)步和工藝的創(chuàng)新，人們對(duì)龍眼葉有效成分、作用機(jī)制及生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行深入研究后，以龍眼葉為原料可能在開(kāi)發(fā)新型藥物，有效治療糖尿病中發(fā)揮巨大作用。