不同產地黃芩體外抑菌作用研究*

黃水金，徐 暉，林 璐，范佐旺，柯曉燕

(1 三明醫學科技職業學院，福建 三明 365000；2 江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；3 三明市中西醫結合醫院，福建 三明 365000)

黃芩為唇形科黃芩屬多年生草本植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，又名土金茶根、山茶根,始記于《神農本草經》[1]，15版藥典記錄黃芩味苦，性寒，具有瀉火解毒、清熱燥濕、止血、安胎等多種功效。主要用于濕溫、暑濕、濕熱痞滿，濕熱黃疸，肺熱咳嗽，肺炎、胸悶、嘔惡，瀉痢，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫瘡毒，胎動不安等癥[2]。黃芩中含有黃酮類、酚苷、醇苷、揮發油、微量元素、氨基酸等成分,其中黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷等黃酮類成分是其主要藥效成分，眾多研究表明黃芩的提取物中主要化合物為黃酮類化合物，黃芩苷和黃芩素具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗過敏、抗疲勞、保護心腦血管等多方面的藥理活性[3-9]，其中抗細菌、真菌方面的作用尤為顯著。施高翔等[10]在研究中表明黃芩對大腸桿菌、葡萄球菌、銅綠假單胞菌、幽門螺桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌等多種細菌和真菌有顯著的抑制作用。黃芩在我國分布廣泛,野生黃芩廣泛分布于華北、東北、華中和西北等地區的12個省市，主產于河北、甘肅、山西、內蒙和東北三省等地[11]。眾多研究表明不同產地黃芩主要化學成分含量存在較大的差異[12-14]，為更直觀的觀察不同產地黃芩在抗細菌、真菌效果方面的差異，本實驗選取河北、山西、內蒙、陜西，甘肅五個代表性產地的黃芩進行體外抑菌試驗。通過實驗測定不同產地黃芩的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的最小抑菌濃度，分析抑菌效果差異，為后續黃芩的開發應用奠定實驗基礎。

1 材 料

1.1 儀 器

JD200-4電子天平，沈陽市多杰電子科技有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，山東博科生物產業有限公司；FS-2000T超聲波提取器，上海生析超聲儀器有限公司；98-1-B電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；HH-s4恒溫水浴鍋，江陰市保利科研器械有限公司；UV-3200紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DNP-9272BS-Ⅲ恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SPH-200D恒溫搖床，上海世平實驗設備有限公司;BSC-1500IIA2-X生物安全柜，山東博科生物產業有限公司。

1.2 菌 株

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均由三明醫學科技職業學院病原微生物實驗室提供。

1.3 藥材與試劑

河北黃芩購于康美藥業股份有限公司；山西黃芩購于山西振東道地藥材開發有限公司；內蒙古黃芩購于豪州市康易飲生物科技有限公司；陜西黃芩購于康佰家大藥房；甘肅黃芩購于玉林市文藥堂商貿有限公司，以上飲片均符合藥典要求。

黃芩苷標準品(批號：110715-202122),中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇，AR級(批號：20220316),國藥集團化學試劑有限公司；營養肉湯瓊脂(批號：200802),杭州濱河微生物試劑有限公司；MH肉湯(批號：220315),杭州濱河微生物試劑有限公司。

2 方 法

2.1 供試品的準備

取河北、山西、內蒙、陜西,甘肅黃芩飲片烘干至恒重,粉碎過二號篩。分別稱取黃芩粗粉10 g，置于1～5號燒杯中，加入10倍量75%乙醇，40 ℃超聲提取1 h，濾過，濾渣加5倍量75%乙醇再次超聲提取1 h，合并兩次濾液，使用旋轉蒸發儀濃縮得到浸膏，烘干殘余溶劑，加純化水超聲溶解后定容至10 mL，即得濃度為1 g/mL黃芩不同溶劑提取液供試品。

2.2 黃芩苷含量的測定

對照品置于烘箱中60 ℃烘干至恒重，稱取9.93 mg以75%乙醇為溶劑溶解定容至50 mL，移液管移取1 mL加75%乙醇定容至10 mL即得濃度為19.86 μg/mL的黃芩苷標準儲備液。分別移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL黃芩苷標準儲備液，75%乙醇定容至10 mL，采用分光光度法[17]在278 nm波長處紫外分光光度計測定吸光度,建立標準曲線。以75%乙醇為溶劑將2.1中供試品溶液稀釋成25 μg/mL，0.45 μm濾頭過濾后濾液為樣品溶液，測定吸光度值，計算供試品黃芩苷百分含量。

2.3 菌懸液的制備

稱取27 g MH肉湯粉末，加純化水1000 mL，加熱煮沸至完全溶解，取3個潔凈的100 mL潔凈錐形瓶編號，各加入50 mL配置好的MH肉湯，塞好硅膠塞，置于高壓滅菌鍋121 ℃高壓滅菌15 min。隨后置于恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，確定無細菌生長。在3個100 mL錐形瓶中分別接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌，置于恒溫搖床37 ℃,轉速60 rmp恒溫培養18 h即得金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌菌懸液。

2.4 倍半稀釋法稀釋藥液

以配置好的MH肉湯為溶劑將2.2中的五個供試品逐步稀釋成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.56 mg/mL、0.78 mg/mL八個濃度，取潔凈試管，編號，擺放好，每個試管分裝2 mL上述稀釋好的供試品溶液，由于選取了三種菌每種平行做3份，故每個濃度分裝9份。另取12支潔凈試管分別加入2 mL MH肉湯，其中9支作為陽性對照，3支作為陰性對照。將上述裝有藥液的試管置于高壓滅菌鍋中121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

2.5 瓊脂平板的制備

稱取營養瓊脂培養基76 g，加蒸餾水2000 mL，加熱溶解，分裝于6個500 mL錐形瓶中，將分裝錐形瓶置于121 ℃高壓滅菌15 min。在潔凈工作臺內取出趁熱倒于經高壓滅菌的培養皿內，厚度約4 mm。蓋好水平放于潔凈工作臺使瓊脂冷卻凝固。待凝固后的培養皿放于恒溫培養箱37 ℃培養24 h，確定無細菌生長。放于3～5 ℃冰箱備用。

2.6 抑菌試驗

在生物安全柜內給2.4中編好號的試管內使用無菌槍頭加入對應菌懸液30 μL。9支陽性對照編好號分為三組，分別加入三種菌懸液，3支陰性對照不加菌懸液，置于恒溫搖床培養箱37 ℃，轉速60 rmp,恒溫培養24 h。由于藥液有一定渾濁度不便觀察細菌生長情況，為更直觀的觀察結果將上述試管的液體使用滅菌的接種環取一環涂布于對應的培養皿，恒溫培養箱37 ℃培養18 h，對比空白組觀察，并記錄最小抑菌濃度。

3 結果和討論

3.1 黃芩苷含量的測定

表1 不同濃度黃芩苷標準品溶液吸光度Table 1 Absorbance of baicalin standard solutions at different concentrations

圖1 黃芩苷標準曲線Fig.1 Standard curve of baicalin

通過分光光度法按2.2中方法建立標準曲線，標準曲線經線性回歸，回歸方程為y=0.0598x+0.0067，R2=0.9995(結果見表1，標準曲線見圖1)。供試品稀釋至25 μg/mL，0.45 μm濾頭濾過，在278 nm波長處紫外分光光度計測定吸光度，計算黃芩苷百分含量(詳見表2)，結果顯示黃芩苷含量均符合藥典要求。

表2 不同產地黃芩苷含量(n=3)Table 2 Baicalin content in different origins (n=3)

3.2 體外抑菌試驗

河北、山西、內蒙、陜西、甘肅所產黃芩醇提浸膏對金黃色葡萄球菌的MIC依次是3.125、6.25、3.125、12.50、6.25 mg/mL；對大腸桿菌的MIC依次是6.25、12.50、6.25、12.50、25.00 mg/mL；對白色念珠菌的MIC依次是6.25、6.25、3.125、12.50、3.125 mg/mL。研究發現河北、山西、內蒙、陜西、甘肅所產黃芩提取液均對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌有明顯的抑菌效果。其中，河北、內蒙黃芩提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌效果最強，內蒙、甘肅黃芩提取物對白色念珠菌抑菌效果最強，詳見表3。

表3 不同產地黃芩提取物MIC(n=3)Table 3 MIC extracts of scutellaria baicalensis from different origins (n=3)

黃芩中含有黃酮類、酚苷、醇苷、揮發油、微量元素、氨基酸等成分。任正肖等[15]在研究中表明黃芩的主要活性成分是黃酮類化合物。黃芩黃酮類化合物中黃芩苷被認為是其主要有效成分。黃芩苷能抑制大腸桿菌的活性，能增加菌液的電導率和大腸桿菌內堿性磷酸酶的含量，通過增加菌體細胞膜和細胞壁的通透性，從而起到抑菌的作用[16]。黃芩苷可通過抑制白念珠菌的DNA、RNA、蛋白質的合成導致白色念珠菌細胞死亡[18]。黃芩苷可能通過抑制α-溶血素的活性而降低肺部金黃色葡萄球菌的細菌量[19]。眾多研究表明黃芩提取物對細菌的抑制作用與其黃芩苷的濃度密切相關。黃芩苷提取率直接影響黃芩的抑菌效果.黃芩苷的水溶性與脂溶性均較低[20-21]，王娜[7]在研究中提到黃芩苷有一定的脂溶性，易溶于醇，因此醇提法提取率比水提法高，本實驗選取75%乙醇作為提取溶劑。關崇新[22]在研究中對比超聲提取法與浸漬法對黃芩中總黃酮的提取率，通過實驗證實超聲提取法優于浸漬法，為提高黃芩苷提取率本實驗采用超聲提取法提取。黃芩在我國分布范圍廣泛，不同地區的黃芩有不同程度的抑菌效果。本實驗采用75%乙醇提取河北、山西、內蒙、陜西、甘肅五個代表性產地所產黃芩，選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌進行體外抑菌試驗得出最小抑菌濃度。黃芩苷含量測定及抑菌實驗結果與文獻查閱的不同產地黃芩苷的含量測定研究結果基本吻合。黃芩具有抑菌效果顯著、資源豐富等優勢，本實驗開展不同產地黃芩體外抑菌試驗研究，為后續黃芩的開發應用提供了實驗基礎。

4 結 論

本實驗選取河北、山西、內蒙、陜西、甘肅五個代表性產地所產的黃芩進行體外抑菌試驗研究。結果表明，五個不同產地的黃芩提取物均有顯著的抑菌效果。河北、內蒙黃芩提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌效果最強，內蒙、甘肅黃芩提取物對白色念珠菌抑菌效果最強。