聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)結(jié)果不確定度的評定

李巧艷，呂 菁，馬茹娟

(中檢西北計量檢測有限公司，陜西 西安 710068)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀通常由控制模塊、溫控模塊、光電模塊、機(jī)械模塊、電源模塊和軟件(控制與數(shù)據(jù)處理軟件)等組成，再新冠病毒肺炎抗疫中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀作為核酸檢測的重要儀器，其中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀中溫度控制模塊是聚合酶鏈反應(yīng)分析儀最很重要的組成部分，溫度校準(zhǔn)也是最非常重要的計量參數(shù)之一。其溫度的準(zhǔn)確性、均勻性和升降溫速率等參數(shù)直接影響著其擴(kuò)增的過程。由于PCR儀是成倍擴(kuò)增的過程，任何微小的溫度變化都可能影響溫度的準(zhǔn)確性，溫度準(zhǔn)確性降低可能會導(dǎo)致核酸檢測結(jié)果的異常，甚至是錯誤的結(jié)果,從而導(dǎo)致檢測結(jié)果異常。目前常見的PCR儀溫度控制部分有24孔、48孔、96孔等，其中96 孔的最為常見。在《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》中 PCR儀校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)器主要是由若干個準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好的溫度傳感器、數(shù)據(jù)采集讀數(shù)分析裝置組成。測量溫度范圍一般為0～120 ℃，溫度校準(zhǔn)裝置測量不確定度≤0.1 ℃。PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器需要在校準(zhǔn)儀器時候必須將溫度探頭靠緊加熱孔，溫度傳感器準(zhǔn)確度必須足夠高、響應(yīng)速度夠快、數(shù)據(jù)傳輸線能夠保證PCR在蓋板閉合的情況是運行正常等要求，故PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置一般都是定制的精密設(shè)備。由于PCR儀基板插孔較小，而且形狀特殊，必須對溫度傳感器進(jìn)行特殊的加工設(shè)計，以緊密貼合聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀基板插孔內(nèi)，提高溫度測量的準(zhǔn)確性。由于PCR反應(yīng)需要溫度在30～95 ℃之間快速轉(zhuǎn)換，熱敏電阻材料必須具備良好的導(dǎo)熱性能，響應(yīng)時間快,故溫度探頭一般使用熱敏電阻，常用銅作為封裝材料，封裝器件的尺寸完全依據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范中要求進(jìn)行設(shè)計，熱敏電阻傳感測溫頭部分由導(dǎo)熱膠封裝固定在銅質(zhì)圓臺內(nèi)部，并可與PCR儀基板插孔直接接觸，既保證了熱敏電阻的熱響應(yīng)時間不受影響，也保證了熱敏電阻與PCR儀基板插孔的緊密貼合，提高了PCR儀溫度測量的準(zhǔn)確度[1]。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分析類儀器，其最大特點是能將微量的DNA按照成倍增加。尤其在此次新冠病毒防疫大戰(zhàn)中，PCR分析儀是病毒檢測中最為重要的設(shè)備，其工作性能是否良好，檢測校準(zhǔn)結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，將直接影響病毒檢測結(jié)果的時效和準(zhǔn)確性，因此，對PCR分析儀的校準(zhǔn)尤為重要。在計量校準(zhǔn)過程中測量不確定度是計量中必不可少的一個重要要素，測量不確定度是根據(jù)所用到信息，表征賦予被測量量值的分散性，是一個非負(fù)參數(shù)，也表明其測量結(jié)果的可信賴程度，是表征測得值的分散性或所在區(qū)間的半寬度，測量不確定度越小，其測得值分散性越小，區(qū)間半寬度越窄，反之則相反，測量不確定度評定方法應(yīng)依據(jù)1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》，又稱GUM評定方法或CUM法，GUM評定方法首先分析測量不確定度的來源，測量不確定度來源一般應(yīng)考慮被測量的定義不完整、復(fù)現(xiàn)被測量的測量方法不理想、對測量過程中對環(huán)境的測量與控制不完善、引用的數(shù)據(jù)或其他參考量值的不準(zhǔn)確等，有時已經(jīng)對測量結(jié)果進(jìn)行修正，給出的是修正后的測量結(jié)果，則還要考慮修正值不完善引入的測量不確定度。一般情況下，在考慮測量不確定度影響因素時，應(yīng)全面的考慮被測量、測量環(huán)境、測量儀器、測量方法等因素。尤其考慮對測量結(jié)果有較大的不確定度因素。以下情況不屬于測量不確定度的來源：(1)在測量過程中，操作人員將數(shù)據(jù)讀錯、記錯；(2)儀器突然跳動等異常情況；(3)測量結(jié)果中的異常值。本文根據(jù)1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》要求以及JJF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》對聚合酶鏈反應(yīng)分析(PCR)儀校準(zhǔn)過程中產(chǎn)生的溫度示值誤差進(jìn)行評定，為正確評價和使用校準(zhǔn)結(jié)果提供了更為合理和科學(xué)的依據(jù)[2]。

1 概 述

1.1 測量依據(jù)

JJF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》[3]。

1.2 測量環(huán)境條件

儀器使用允許的環(huán)境條件，測量過程中應(yīng)測量和記錄環(huán)境的溫度、相對濕度。

1.3 測量標(biāo)準(zhǔn)

表1 標(biāo)準(zhǔn)器配置表Table 1 Standard configuration table

1.4 被校對象

聚合酶鏈反應(yīng)分析(PCR)儀。

1.5 測量方法

(1)校準(zhǔn)前需將聚合酶鏈反應(yīng)分析(PCR)儀開機(jī)并提前預(yù)熱30 min；

(2)將PCR儀及溫度校準(zhǔn)裝置中標(biāo)準(zhǔn)器各部件與數(shù)據(jù)采集分析儀連接好并開機(jī)，還要在溫度傳感器表面上涂抹適量的導(dǎo)熱油；

(3)按規(guī)程要求將溫度傳感器放置于PCR儀加熱孔中首先進(jìn)行模擬測試，或者參照客戶提供的PCR儀說明書要求設(shè)定其溫度控制程序；

(4)全部準(zhǔn)備完成后啟動溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器，記錄整個采集過程并保存原始記錄，便于最終的數(shù)據(jù)處理。

1.6 測量不確定度校準(zhǔn)結(jié)果的使用

符合上述條件的測量結(jié)果，一般可參照使用本不確定度的評定方法。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：ΔTd——溫控裝置工作區(qū)域內(nèi)溫度示值誤差，℃

Ts——溫控裝置工作區(qū)域內(nèi)設(shè)定溫度值，℃

3 測量不確定度來源分析

(1)聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)結(jié)果測量重復(fù)性引入的不確定度；

(2)溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器溫度傳感器引入的不確定度。

4 測量不確定度分量計算

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)結(jié)果測量重復(fù)性引入的不確定度

在各個溫度校準(zhǔn)點的測量時間段內(nèi)，分別讀取15個溫度傳感器的數(shù)據(jù)，見表2，計算其實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差s。

表2 重復(fù)性引入不確定度數(shù)據(jù)Table 2 Repeatability introduces uncertainty data

根據(jù)測量結(jié)果計算：

4.2 溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器溫度傳感器引入的不確定度

溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器溫度傳感器校準(zhǔn)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)溫度傳感器校準(zhǔn)證書得到，取包含因子k=2。

5 合成不確定度

5.1 測量不確定度分量匯總及計算表

表3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總表Table 3 Standard uncertainty summary table

5.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算

5.3 擴(kuò)展不確定度評定

取包含因子k=2，則PCR儀溫度示值誤差的擴(kuò)展不確定度用U=2u(Δ)計算，結(jié)果見表4。

表4 合成不確定度和和擴(kuò)展不確定度計算結(jié)果Table 4 Calculation results of synthetic uncertainty and extended uncertainty

6 結(jié) 論

(1)該文聚合酶鏈反應(yīng)分析儀不確定度是根據(jù)JJF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》評定，聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)不確定度評定主要來源于：1)聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)結(jié)果測量重復(fù)性引入的不確定度，采用A類評定方法；2)溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器溫度傳感器引入的不確定度，采用了B類評定方法。然后合成測量重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)裝置溫度傳感器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc，最后取包含因子k=2，計算出擴(kuò)展不確定度U。

(2)在整個PCR溫度參數(shù)校準(zhǔn)的過程中，需要注意：①采用的定制溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器能夠滿足不同種類的PCR儀檢測，其測溫探頭必須能夠完全緊貼于PCR儀反應(yīng)孔內(nèi)，不同廠家 PCR儀結(jié)構(gòu)各不相同，反應(yīng)孔一般具有0.1 mL或者0.2 mL兩種型號，使用的溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器需滿足緊貼性要求，否則影響聚合酶鏈反應(yīng)分析儀溫度均勻性等結(jié)果的準(zhǔn)確性，由于溫度相關(guān)參數(shù)的校準(zhǔn)主要采用專用的溫度采集分析裝置，一般分為有線或者無線兩種傳輸數(shù)據(jù)探頭，若使用有線溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)去時需在PCR儀蓋板閉合的情況下不影響設(shè)備運行；②聚合酶鏈反應(yīng)分析儀溫度參數(shù)校準(zhǔn)時需先打開校準(zhǔn)設(shè)備并預(yù)熱，在進(jìn)行PCR儀溫度程序設(shè)定，同時至少進(jìn)行2個循環(huán)以上的反應(yīng)過程，便于溫度示值誤差和溫度均勻度數(shù)據(jù)的采集，數(shù)據(jù)采集的時候盡量等溫度指標(biāo)平穩(wěn)后再選溫度點進(jìn)行記錄，減小溫度過沖對于結(jié)果的影響；③溫度校準(zhǔn)裝置標(biāo)準(zhǔn)器應(yīng)該定期進(jìn)行維護(hù)和自身校準(zhǔn)，保證其量值的準(zhǔn)確性與校準(zhǔn)裝置的穩(wěn)定性[4]。

(3)PCR儀技術(shù)的進(jìn)步，能夠很好的解決了溫度不均勻性的問題，為PCR實驗數(shù)據(jù)提供了溫度保障，確保了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，穩(wěn)定的溫度控制系統(tǒng)，數(shù)字化的顯示模式，使實驗的顯示和操作更為清晰和直接，甚至考慮到了PCR反應(yīng)體系對溫度變化的影響，模塊具有溫度梯度功能，為科研工作者提供30 ℃的溫度梯度范圍，能夠滿足各種實驗需求。PCR儀控溫精度更高、升降溫更快、模塊溫度更均勻、外形體積更小、運行環(huán)境更安靜，能夠使初學(xué)者可以快速、安全地學(xué)會使用。

(4)PCR儀在實驗室質(zhì)量管理及維護(hù)時注意事項：

①使用PCR儀式要嚴(yán)格遵守本機(jī)說明書中規(guī)定的環(huán)境條件、電源、灰塵、振動等的要求；

②打開PCR儀儀器時候動作要輕盈，以防把儀器損壞；

③PCR儀工作狀態(tài)時候禁止對儀器進(jìn)行操作；

④要定期使用無水酒精清潔加熱孔，在清潔前PCR儀一定要關(guān)掉電源；

⑤進(jìn)入PCR實驗室的需要用PCR儀進(jìn)行樣品檢測的人員，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實驗原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項等規(guī)范的培訓(xùn)；

⑥產(chǎn)品出現(xiàn)故障時要及時請專業(yè)的維修人員或廠家的維修人員維修。

(5)隨著科技的不斷進(jìn)步發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)分析儀是完成聚合酶鏈反應(yīng)的必備儀器，是微量核酸測量必須的主要設(shè)備之一，PCR儀技術(shù)的應(yīng)用也也在不斷更新與完善，它將滲透到生活的各個領(lǐng)域，也已經(jīng)廣泛普及于生物學(xué)相關(guān)的各個實驗室，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測、食品、醫(yī)藥、基因工程等方面應(yīng)用更為廣泛[5]。