化妝品中10種糖皮質激素的液質檢測方法

梁靜文

(廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663)

糖皮質激素是具有環戊烷多氫菲核的一類化合物，該類物質可以抑制纖維細胞增生，減少5-羥色胺形成，從而對皮膚有一定的嫩白作用[1]，但長期使用糖皮質激素會引發激素依賴性皮炎、色素沉著、痤瘡等不良反應，我國《化妝品安全技術規范》、歐盟化妝品規程(Direct ive76/768EEC)均將其列為化妝品中的禁用組分[2-3]。近年來，化妝品中非法添加糖皮質激素的現象普遍，而法定檢測方法主要是GB/T 24800.2 -2009中涵蓋的41種糖皮質激素[4]和《化妝品安全技術規范》中覆蓋的63種糖皮質激素。糖皮質激素的種類繁多，不法商家往往鉆標避規，添加標準檢驗方法以外的激素成分，因此，不斷更新檢測組分，對打擊非法添加有重要意義。

目前，化妝品中糖皮質激素的檢測方法包括了分光光度法[5]、薄層色譜法[6]、液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]和液相色譜-質譜法[4,9]等。其中，液質方法因定性準確、快速，檢測種類多，是目前糖皮質激素的主要檢測方法。本文建立了標準檢驗方法以外的10種糖皮質激素的液質檢測方法，檢測組分包括二氟拉松、醋丙氫可的松、甲羥松、特戊酸硫氫可的松、甲基潑尼松龍乙丙酸酯、帕拉米松乙酸酯、去羥米松、16α-羥基潑尼松龍、氟氫可的松、倍他米松17-丁酸脂，為發現化妝品中激素類物質的非法添加提供檢測依據。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Waters XEVO TQ-XS高效液相色譜/質譜聯用儀；Elma S300H 超聲波清洗器；Eppendorf 5801R 型高速離心機；Ika LabDancer 型渦旋混合器；Millipore Milli Q Reference 型超純水發生器。

乙腈，色譜純；實驗用水為超純水。

對照品：二氟拉松(麥克林，批號M180920947，含量99.41%)、醋丙氫可的松(畢得醫藥，批號BQL869，含量95%)、甲羥松(Targetmol，批號T0977，含量97.73%)、特戊酸硫氫可的松(TRC，批號5-ISU-60-1，含量98.00%)、甲基潑尼松龍乙丙酸酯(畢得醫藥，批號PQC686，含量95%)、帕拉米松乙酸酯(TRC，批號10-GUY-86-3，含量95%)、去羥米松(畢得醫藥，批號BKA116，含量99.60%)、16α-羥基潑尼松龍(畢得醫藥，批號AMP175，含量97%)、氟氫可的松(TRC，批號2-YHU-138-1，含量98%)、倍他米松17-丁酸脂(TRC，批號3-ACH-84-2，含量97%)。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：水；流動相B：乙腈，流動相比例見表1。

表1 流動相梯度條件Table 1 Gradient mobile phase for HPLC

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；采集方式：多反應監測(MRM)模式；霧化氣壓力：7.0 Bar；干燥氣流量：1000 L/h；干燥氣溫度： 500 ℃；毛細管電壓：2.5 kV；采集時間窗口：2 min。其他質譜參數見表2。

表2 質譜參數Table 2 MS parameters for multiple reaction monitoring

1.3 標準溶液的配制

標準貯備溶液：分別準確稱取標準物質各10.0 mg，用乙腈分別溶解定容至10.0 mL，于-18 ℃下冷凍存。

混合標準溶液：分別吸取標準貯備液各0.025 mL至50 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，制成濃度為500 ng/mL的標準混合儲備溶液，于-18 ℃下冷凍保存(該工作溶液現配現用)。

系列混合標準溶液的制備：分別精密吸取0.1 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1 mL新配的500 ng/mL混合標準溶液于25 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液配制，得到2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的系列混合標準溶液。

1.4 樣品前處理

稱取樣品0.2 g(精確到0.001 g)，置于10 mL具塞比色管中，加入少量乙腈，在渦旋混合儀上振蕩30 s至試樣與提取溶劑混合均勻，然后加入乙腈至近刻度，超聲提取20 min，靜置至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，以4000 r/min離心10 min，準確移取上層清液1 mL于10 mL離心管中，準確加入50%乙腈溶液1 mL稀釋，搖勻，經0.22 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結果和討論

2.1 色譜和質譜測定條件的優化

采用液相色譜-質譜法的多反應監測模式進行化妝品中糖皮質激素的檢測，具有選擇性好、靈敏度高的優點。采用梯度洗脫的方法能更好的實現分離?？疾炝瞬煌牧鲃酉囿w系：乙腈-水和乙腈(含0.1%乙酸)-水(含0.1%乙酸)，經過實驗，對比兩組流動相體系的洗脫效果，最終選擇乙腈-水作為流動相，更加方便，易操作。

2.2 樣品前處理方法的優化

對比加入飽和氯化鈉分散后再用乙腈提取和乙腈提取這兩種處理方法，發現前者回收率偏低，后者回收率較高，故采用乙腈提取的處理方法。

2.3 色譜柱的選擇

比較了Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)兩款色譜柱的分離效果，經過多次實驗，結果表明，使用Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)色譜柱時，各化合物的分離度和峰形更好，最終選用Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)色譜柱。

2.4 標準曲線及方法檢出濃度

在優化的色譜-質譜條件下，對5個水平的系列混合標準溶液(2～50 ng/mL)進行測定，記錄色譜圖，多反應監測(MRM)掃描方式下的 TIC圖譜見圖1。以色譜峰面積對其質量濃度進行線性回歸，以定量離子信噪比(S/N)大于3 確定樣品的檢出限(LOD)。10種糖皮質激素的方法檢出限為0.03 mg/kg，在2～50 ng/mL線性范圍內，相關系數大于0.99，表明各化合物均具有良好的線性關系。線性回歸方程、相關系數、方法檢出濃度如表3所示。

圖1 10種對照品TIC圖譜Fig.1 TIC chromatograms of 10 standard substances

表3 10種糖皮質激素的線性回歸方程、相關系數和方法檢出濃度Table 3 Regression equations，correlation coefficients (r2) and detection limit of the 10 glucocorticoids

2.5 方法精密度和回收率

選取水劑、膏霜兩種化妝品常見劑型進行回收率和精密度試驗。添加濃度為1 μg/kg，按1.4方法處理，回收率和精密度結果如表4所示，結果表明，精密度結果為3.4%～6.1%；方法回收率為95.2%～116.3%，相對標準偏差為1.0%～9.0%。

表4 回收率和精密度測定結果Table 4 Determination results of recoveries and precisions

3 結 論

建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測化妝品中10種糖皮質激素的檢測方法，擴充了激素法定檢測方法的測定種類，方法結果準確快速，能夠作為化妝品中的激素非法添加的檢驗依據。