中藥分析實驗藿香正氣水中乙醇含量測定探討*

舒樂新，劉 雪，黃皓宇，魏金霞，許妍妍，李遇伯

(天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617)

中藥分析學是我校中藥學和中藥制藥專業大四學生的一門專業必修課，其中理論課54學時，實驗課36學時，可見這是一門實用性很強的學科，所以實驗內容的設置尤其重要。中藥分析內容主要涉及雜質檢查、鑒別和含量測定三大塊，藿香正氣水中乙醇的含量測定實驗包含溶劑的限量檢查和含量測定。

藿香正氣水是日常生活中比較常見的中成藥方劑，它的功效是解表化濕，理氣和中。臨床主要用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒等[1]。由于它屬于町劑，制備過程中有廣藿香油、紫蘇葉油這些揮發性成分存在，因此需要使用適當濃度的藥用乙醇溶液，來提高有效成分的提取效率。但乙醇含量過高會產生毒副作用，而過低助溶揮發性成分含量會減少，因此需要嚴格控制乙醇濃度。《中國藥典》規定對該類制劑需做乙醇量檢查。2020版規定藿香正氣水中乙醇含量應在40%～50%，主要采用氣相色譜法測定各種含乙醇制劑中在20 ℃時乙醇含量[2]。

氣相色譜條件的選擇對乙醇含量結果的影響具有關鍵性作用，本實驗主要對不同分流比選擇和不同柱溫選擇對色譜條件進行考察，以探究色譜圖的變化，摸索得到最佳實驗條件以達到快速、準確測定乙醇含量的目的。此實驗主要作為中藥分析學實驗的教學改革項目，目的是讓學生了解此方面的知識，提高動手能力。能夠獨立完成藿香正氣水的乙醇含量測定實驗，掌握氣相色譜法的原理和組成，適用范圍等。毛細色譜柱法的流程，內標法定量的操作流程，為將來從事藥物分析行業打下良好的基礎。

1 儀器與試劑

氣相色譜儀配備有氫焰離子檢測器(Agilent 7820A型)，美國安捷倫公司制造；實驗用水為娃哈哈飲用純凈水，天津娃哈哈食品有限公司制造；藿香正氣水(批號為060034，060038，060040)，天津中新藥業集團股份有限公司隆順榕制藥廠制造；乙醇、正丙醇均使用色譜純，天津康科德科技有限公司制造。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，進樣方式：手動進樣。進樣口溫度：190 ℃。檢測器溫度：250 ℃。柱溫：初始溫度為40 ℃，保持4 min，再以25 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持5 min。載氣：氮氣，載氣流速：25 mL/min，氫氣流速：30 mL/min，空氣流速：300 mL/min，柱流速：1 mL/min。分流比為20:1，進樣量：0.6 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密量取無水乙醇1 mL，內標物正丙醇1 mL置于100 mL容量瓶中，加超純水稀釋，定容至刻度線為止，搖勻，經過微孔濾膜過濾，所得續濾液即為對照品溶液，置于冰箱中密封保存。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取藿香正氣水溶液1 mL，正丙醇1 mL置于100 mL容量瓶中，加超純水稀釋，定容至刻度線為止，搖勻，經過微孔濾膜過濾，所得續濾液即為供試品溶液，置于冰箱中密封保存。

2.4 色譜條件考察

2.4.1 分流比選擇

在確定分流比時保持其他色譜條件一致為HP-5毛細色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)進樣方式：手動進樣，進樣口溫度：190 ℃，檢測器溫度：250 ℃。載氣：氮氣，載氣流速：25 mL/min，氫氣流速：30 mL/min，空氣流速：300 mL/min，柱流速：1 mL/min。升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持4 min，再以25 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持5 min。進樣量：0.6 μL，僅改變分流比在10:1至50:1進行了多組試驗。

表1 分流比的影響Table 1 Effect of the Split Ratio

隨分流比增大，保留時間增大，峰面積減小，分離度增大，結果需考慮適宜的分離度與峰面積，最終選擇了分流比20:1作為色譜條件。

2.4.2 柱溫的選擇

表2 初始柱溫影響Table 2 Effect of the initial column temperature

對于乙醇的分離來講，初始柱溫是一大重要因素，本文以“2.2”下對照品溶液作為樣品，分別以40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃等溫度作為初始溫度，其他的色譜條件均保持一致。

由表2可知柱溫升高，出峰前移，保留時間縮短，分離度降低，峰面積與對稱因子未見明顯變化規律。考慮選擇分離度高，保留時間適宜的條件，最終選擇40 ℃為初始柱溫。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗

圖1 內標物正丙醇色譜圖Fig.1 Chromatogram of n-propanol as internal standard

圖2 乙醇和正丙醇混和標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard of ethanol and n-propanol

圖3 乙醇和正丙醇混合樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of a mixed sample of ethanol and n-propanol

分別取1%(vol)正丙醇溶液、“2.2”所述對照品溶液和“2.3”所述供試品溶液，根據“2.1”項下的色譜條件進行測定，對色譜峰保留時間對比，正丙醇保留時間為3.35 min，通過比較色譜圖可確定供試品溶液的乙醇峰位置，其保留時間為2.91 min，該峰峰形良好，且供試品中的其他微量成分并不干擾乙醇峰的出峰及測定，因此本試驗方法適用于藿香正氣水中乙醇含量的測定。

2.5.2 檢測限與定量限

本試驗按照“2.2”下1.0%(vol)對照品溶液為初始濃度，不斷稀釋。精密量取母液1.0 mL，加入5 mL帶蓋離心管中，再精密量取1.0 mL超純水加入其中，蓋蓋子，搖勻，即得低濃度溶液。依照此法對溶液不斷稀釋，測量其信噪比。對溶液不斷稀釋，測量其信噪比，得到定量限為0.001%(vol)，檢測限為0.0007%(vol)。

2.5.3 線性關系考察

精密量取無水乙醇5 mL加入100 mL容量瓶中，加超純水定容，配置成5%(vol)的儲備液，置于冰箱冷藏待用。精密量取5%(vol)儲蓄液1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0、30.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，加入正丙醇1 mL，加入超純水定容，分別配制成濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.5%(vol)的對照品溶液，置于冰箱冷藏待用。精密吸取乙醇不同濃度系列對照品溶液各0.6 μL，以“2.1色譜條件”進行進樣，測定。用所得數據進行線性回歸，縱坐標Y為乙醇峰面積與內標物峰面積的比值，橫坐標X為乙醇濃度。結果得回歸方程為Y=0.806X+0.0046，相關系數R=0.9997。依數據可見，在0.05%～1.5%(vol)濃度范圍之間，線性關系良好。

2.5.4 精密度試驗

取“2. 2”項下對照品溶液，依照“2. 1”下色譜條件重復進樣6次，記錄乙醇峰與正丙醇峰峰面積，計算兩者比值，計算平均值與RSD。結果得乙醇峰峰面積與正丙醇峰峰面積比值的RSD為1.7%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5.5 回收率試驗

取生產批號為060034的藿香正氣水三份，由所得數據可知其乙醇含量為46.0%(vol)，將三份樣品各1.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，分別加入無水乙醇，加入量為溶液乙醇含量的80%、100%、120%，加入正丙醇1.0 mL，再加入超純水溶解，稀釋至刻度線，搖勻，按照“2.1”項下色譜條件進樣，計算乙醇總含量，減去樣品中原有含量，算出加樣回收率。加樣回收率分別為97.11%，101.85%，98.03%，RSD分別為0.6%，1.1%，1.2%(n=3)。

2.5.6 重復性試驗

取同一批號的藿香正氣水樣品，生產批次為060034，按照“2.3”項下配置方法制備6份供試品，分別進樣測定，記錄乙醇峰與正丙醇峰峰面積，計算兩者比值，計算平均值與RSD。RSD為1.7%(n=6)，本試驗方法重復性良好。

2.5.7 穩定性試驗

取同一批號的藿香正氣水樣品，生產批次為060034，按照“2.3”項下配置方法制備供試品溶液，而后，分別于0，1，2，4，6 h進樣，記錄乙醇峰與正丙醇峰峰面積，計算兩者比值，計算平均值與RSD。RSD為1.6%，表明該供試品溶液在6 h內穩定。

2.5.8 樣品測定

取生產批號分別為060034，060038，060040的3批藿香正氣水藥品，按照“2.3”項下制備方法分別配制三份供試品溶液，每份供試品溶液進樣三次，記錄兩峰峰面積，按照內標法內容以峰面積計算出供試品乙醇含量。

結果見表3，三批藥品的乙醇含量分別為46.0%、45.0%、48.0%。中國藥典2020版中規定，藿香正氣水中的乙醇含量應在40%～50%之間，綜上所述，這三批藥品符合國家藥典標準。

表3 不同批次樣品的乙醇含量測定Table 3 Determination of ethanol content of different batches of samples

3 結 論

本文采用氣相色譜法對藿香正氣水的乙醇進行含量測定，建立并優化了含量測定方法。氣相色譜條件對乙醇含量結果的影響因素主要有色譜柱的選擇、定量方法、內標物的選擇、進樣方式等[3-8]。由于本實驗使用手動進樣，與自動進樣方式相比較，手動進樣時進樣量會存在差異，從而導致重復性差，RSD值偏高，為了降低進樣量帶來的誤差，本實驗使用了內標法。在稀釋醇類物質時，常常選用超純水或甲醇作稀釋劑[9-10]，但由于甲醇是一種有毒的揮發性成分，因此本次試驗所用溶劑為超純水，乙醇及內標物正丙醇均能夠在水中有較好的溶解，并且超純水不會干擾乙醇峰與正丙醇峰，同時能夠避免對學生身體的危害。但使用水作為溶劑進樣，長期使用有可能會導致色譜柱的損傷，縮短色譜柱的壽命，于是在實驗中進行了試驗條件的改動，在每一次進樣檢測后，附加一次程序升溫，以除去色譜柱雜質并保養色譜柱。

隨著初始柱溫升高，乙醇色譜峰的保留時間逐漸縮短，出峰前移，乙醇峰與正丙醇峰的分離度也越來越差。為了乙醇峰與正丙醇峰有較好的分離，并且兩峰有適宜的保留時間與較好的峰形，以及對色譜柱的保護，本文最終確定了40 ℃作為初始柱溫。在試驗條件的探究階段，色譜峰均出現了分叉，拖尾等狀況，發現導致這些原因主要與儀器進樣口內玻璃內襯管污染和樣品濃度過高導致色譜柱超載有關，通過更換新的玻璃內襯管和降低樣品濃度，峰形和分離度達到了要求。在實驗過程中，必須認真把控每個環節，發現問題，解決問題。

本實驗采用氣相色譜法，以分組協作方式進行實驗。實驗操作涉及樣品的制備、儀器進樣、數據記錄與處理等，需要一組同學明確分工，每一組由一部分同學負責供試品溶液的制備，一部分同學負責標準溶液的進樣及儀器操作，通力合作，可以高效完成實驗。本實驗可發揮每個學生在小組中的作用，調動學生參與實驗的積極性，培養學生的團隊協作精神。同時，本實驗氣相色譜法采用手動進樣法，進樣體積僅0.6μL，需要學生熟練掌握微量進樣針的用法及進樣操作，借此引導學生具備嚴謹細致的科學態度，確保實驗中的每一個環節都正確操作，才能最終獲得準確的結果。鼓勵學生鉆研業務，追求卓越，且此實驗用藥為學生身邊常用藥，增加學生學習的興趣，此實驗的設置適合于中藥分析學實驗教學。