自閉癥模型小鼠神經遞質水平病理性改變的機制研究

趙佳佳 趙蓓 高未 李杰 蔡俏 應小明

自閉癥又稱孤獨癥，是廣泛性發育障礙的代表性疾病，核心癥狀主要包括情緒表達困難、社交互動障礙，語言和非語言的溝通障礙、限制行為與重復刻板動作以及明顯的興趣狹窄[1-2]。除上述三大核心癥狀外，自閉癥患者還可能伴發其他臨床癥狀，如智力障礙、癲癇、睡眠障礙、感知系統異常、頭圍異常、胃腸道不適、免疫及代謝異常等[3-4]。由于自閉癥具有高度臨床異質性和病因異質性，其真正的發病機制目前尚未完全清楚[5-6]。相關研究表明，自閉癥的發生可能受到基因和環境因素的共同影響[7]。本文通過構建自閉癥小鼠模型，對其神經遞質[包括γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺等]水平病理性改變的機制作一探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 12只雌性、6只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，無特定病原體，購自上海斯萊克，SCXK（滬）2017-0005，合格證號：20170005047072。試驗前小鼠在動物房環境中適應1周。飼養環境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。本實驗委托杭州赫貝科技有限公司機構完成，實驗方案經該公司動物實驗倫理委員會審查通過。

1.2 主要試劑和儀器 高爾基染色試劑盒（批號：PK401）購自美國FD Neuro Technologies Inc公司，丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA；批號：K1823102）購自四川科瑞德制藥股份有限公司，聚偏二氟乙烯膜（批號：IPVH00010）購自美國 Millipore公司，GABA（批號：14012）試劑盒購自美國 R&D公司，5-HT（批號：17101）試劑盒購自美國R&D公司，多巴胺（批號：14082）試劑盒購自美國R&D公司，Arc一抗（批號：H00023237-B01）購自艾美捷科技有限公司，EGR2一抗（批號：ab63943）購自上海恒斐生物科技有限公司，S-100a9一抗（批號：H00006280-M01A）購自艾美捷科技有限公司。水迷宮系統購自北京智鼠多寶科技有限責任公司，CM186UV型冷凍切片機購自德國Leica公司，BX43型電子顯微鏡購自日本Olympus公司，AB SCIEX 5500 QTRAP質譜儀購自美國AB SCIEX公司，1290 Infinity LC超高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，5430R低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司，Mini-Proten Tetra System電泳系統、ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀、定量PCR儀及配套的分析軟件均購自美國Bio-RAD公司。

1.3 自閉癥小鼠（子代）模型的建立 將健康成年雌鼠12只和雄鼠6只合籠，受孕后將雌鼠按隨機數字表法分為模型組（母代）和對照組（母代），記為受孕0 d。模型組（母代）于受孕10、12 d腹腔注射VPA注射液（使用0.9%氯化鈉注射液配置，濃度為250 mg/ml）1.2 ml/kg，對照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。新生鼠出生當天記為出生0 d，模型組（子代）于出生4 d后進行母子分離實驗。將新生小鼠移至遠離親本的新房間，分離24 h后將新生小鼠送回，與親本同籠。建模8周后，取模型組（子代）、對照組（子代）各12只用于以下實驗。

1.4 小鼠（子代）行為學觀察 采用理毛實驗、水迷宮實驗和曠場實驗。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只進行行為學觀察。（1）理毛實驗：觀察并記錄小鼠5 min內的理毛次數。（2）水迷宮實驗：將小鼠置于水迷宮中央區，記錄小鼠搜尋站臺的時間，即潛伏時間。（3）曠場實驗：將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場裝置中，測量小鼠5 min內的運動距離，記錄某一肢體進入曠場中央格子的次數（即穿越格子次數）、后肢站立次數。

1.5 小鼠（子代）海馬錐體神經元結構觀察 采用高爾基染色法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取腦組織并用紙巾輕輕擦拭，采用聚乙二醇包埋，置于-20℃冷凍切片，切片厚度100 μm，采用黏附載玻片貼片，避光，于30 min內進行高爾基染色。避光，蒸餾水洗2次，4 min/次；用吸水紙輕輕吸去多余水分，將工作液滴于組織上，室溫下放置12 min，蒸餾水洗2次，4 min/次；不同乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在電子顯微鏡下觀察，膠質細胞的胞體呈棕黑色或黑色為神經元染色結果，使用Image系統計算錐體神經元數量。

1.6 小鼠（子代）腦皮層神經遞質水平檢測 采用高效液相色譜法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取出腦皮層樣本并分別稱取60 mg進行實驗。加入 800 μl甲醇乙腈溶液（1∶1，v/v），渦旋 60 s；低溫超聲30 min，共2次，-20℃放置1 h；14 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液；冷凍干燥，-80℃保存樣本。采用高效液相色譜法測定GABA、5-HT和多巴胺水平。

1.7 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。對照組、模型組小鼠（子代）各取3只，斷頭處死，取0.1 mg腦組織，加入 500 μl裂解液，充分勻漿；4 ℃、11 000 r/min離心20 min，將上清液轉移至新的1.5 ml離心管中，置于-80℃保存；采用BCA法測定蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳（先80 V 30 min，再120 V 60～70 min）；將凝膠中的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；過夜孵育一抗；TBST洗一抗；室溫孵育二抗1 h；TBST洗二抗6～7次，6 min/次；曝光顯色。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.8 統計學處理 采用SPSS 26.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠（子代）理毛實驗結果比較 模型組小鼠（子代）理毛次數為（25.67±6.51）次，明顯多于對照組小鼠（子代）的（7.31±3.24）次，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 兩組小鼠（子代）水迷宮實驗結果比較 兩組小鼠（子代）第1天潛伏時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而第 2、3、4、5天模型組小鼠（子代）潛伏時間均明顯長于對照組小鼠（子代），差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 兩組小鼠（子代）潛伏時間比較（s）

2.3 兩組小鼠（子代）曠場實驗結果比較 模型組小鼠（子代）總運動距離明顯短于對照組小鼠（子代），且穿越格子次數、后肢站立次數均明顯少于對照組小鼠（子代），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠（子代）曠場實驗結果比較

2.4 兩組小鼠（子代）海馬錐體神經元結構比較 模型組小鼠（子代）較對照組小鼠（子代）的海馬錐體神經元胞體萎縮，錐體神經元數量明顯減少[（0.06±0.04）個/μm 比（0.32±0.11）個/μm]，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。

圖1 兩組小鼠（子代）海馬錐體神經元高爾基染色所見（電子顯微鏡下，×1 000）

2.5 兩組小鼠（子代）腦皮層神經遞質水平比較 模型組小鼠（子代）腦皮層GABA、5-HT水平均高于對照組小鼠（子代），而多巴胺水平明顯低于對照組小鼠（子代），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組小鼠（子代）神經遞質水平比較（nmol/g）

2.6 兩組小鼠（子代）腦組織 Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達水平比較 模型組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2蛋白表達水平均高于對照組小鼠（子代），而S-100a9蛋白表達水平明顯低于對照組小鼠（子代），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2和表4。

表4 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達水平比較

圖2 兩組小鼠（子代）腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達的電泳圖

3 討論

自閉癥是一種神經系統發育障礙疾病，起病于嬰幼兒期，一般在3歲前發病，嚴重影響兒童的健康，甚至對其成年后的學習、工作和生活均有深遠影響[8]。近年來，自閉癥患病率呈不斷上升趨勢[9]。新生兒出生后早期有一段特定時間窗，其大腦能非常敏銳地感知外界環境刺激并獲取外部信息，這段時期為腦發育的關鍵期[10]。研究表明，在新生兒腦發育關鍵期的經歷可以塑造大腦神經環路，對其成年后的認知、情感及行為均有影響[11]。生命早期應激被認為是多種精神疾病的重要風險因素。針對哺乳動物母嬰關系在早期生長發育、學習認知和社交行為中的重要作用，早期母愛剝奪被認為是早期應激事件之一。根據靈長類動物以及人類的研究結果，早期母愛剝奪會影響個體的神經發育和行為表現，且這些影響可能持續一生[12]。新生幼鼠的早期生長主要依賴于母鼠所提供的溫暖、營養與庇護，母嬰聯系在出生后2周內尤為重要。以嚙齒類動物（大鼠、小鼠）母子分離實驗模擬人類生命早期母子分離的特征，已成為研究早期經歷影響個體發育的主要模型[13]。既往實驗表明，早期母子分離可導致大鼠、小鼠行為學發生改變，這些改變呈現出自閉癥類似行為，如經歷早期母子分離的小鼠自發活動減少，社交行為受損，同時焦慮、抑郁類似行為明顯增加[14-15]。

本實驗建立了自閉癥小鼠模型，結果表明與對照組小鼠（子代）比較，模型組小鼠（子代）理毛次數明顯增多，第2、3、4、5天潛伏時間明顯延長，總運動距離明顯縮短，穿越格子次數及后肢站立次數均明顯減少。這提示模型組小鼠（子代）存在社交障礙、探索能力異常等。此外，本實驗結果顯示模型組小鼠（子代）錐體神經元數量少于對照組小鼠（子代），提示模型組小鼠（子代）的海馬錐體神經元胞體萎縮。在中樞神經系統中，突觸傳遞最重要的方式是基于神經遞質的神經化學傳遞。近年來研究發現，神經遞質在神經系統疾病發病機制中的作用備受關注[16]，GABA、5-HT和多巴胺是重要神經遞質指標。有研究發現，神經系統疾病患者發作期血液中GABA、5-HT水平均明顯升高，而多巴胺水平明顯降低[17]。本實驗結果顯示，模型組小鼠（子代）腦皮層GABA、5-HT水平明顯升高，而多巴胺水平明顯降低，提示自閉癥模型小鼠存在神經遞質水平改變。進一步檢測腦組織Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達水平發現，模型組小鼠（子代）Arc、EGR2蛋白表達水平明顯升高，而S-100a9蛋白表達水平明顯降低。這提示自閉癥模型小鼠存在行為學異常和神經遞質水平改變，可能與Arc、EGR2蛋白表達上調、S-100a9蛋白表達下調的機制有關，但有待后續研究作進一步證實。

綜上所述，自閉癥模型小鼠存在行為學異常和神經遞質水平改變，可能與Arc、EGR2蛋白表達上調、S-100a9蛋白表達下調的機制有關。但本研究也存在一定的局限性，今后仍需開展多中心、多樣本的研究，以提供更可靠的參考依據。