HBV相關性肝癌患者血清中lncBRM的表達及臨床診斷價值

臧倩 樓衷晗 包劍鋒

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發病率居全世界常見惡性腫瘤的第6位，全球每年約有74.5萬人死于HCC，HCC已成為第2大致死性腫瘤[1-3]。HCC是一種獨特的多因素疾病，HBV是其重要的危險因素[4]。我國是乙肝大國，70%～90%HCC患者的發病與HBV感染相關[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為重要的調控因子參與了腫瘤發生、發展、轉移等多種細胞生物學進程[6-7]，目前已有臨床研究將lncRNA應用于部分腫瘤的早期診斷[8]。BRM是一種堿基對不超過200 nt的lncRNA。研究發現BRM相關長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA for association with BRM，lncBRM）在肝癌干細胞（cancer stem cells，CSCs）中高表達[9]。lncBRM是CSCs自我更新、維持腫瘤發展所必需的，lncBRM表達水平與肝癌患者的腫瘤惡性程度呈正相關。然而目前關于lncBRM的研究多局限于分子水平，對BRM在HBV相關性肝癌的診斷價值尚未明確。因此，本研究旨在探討HBV相關性肝癌患者血清中lncRNA的表達及臨床診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年2月至2020年1月杭州市西溪醫院收治的HBV相關性肝癌患者57例作為研究對象（肝癌組），其中男48例，女9例；年齡21～80（54.81±11.57）歲。HBV相關性肝癌納入標準：（1）根據《原發性肝癌診療規范（2019年版）》[10]診斷為HBV相關性肝癌；（2）肝內占位病灶或肝外轉移灶活檢、外科手術切除組織標本，經病理組織學和（或）細胞學檢查診斷為HCC；（3）未進行手術、射頻消融、介入治療（無水乙醇注射、肝動脈化療栓塞術等）、靶向治療、放療、化療及免疫治療等其他治療的初診患者。排除標準：（1）之前于外院已進行手術、射頻消融、介入治療（無水乙醇注射、肝動脈化療栓塞術等）、放療、化療及免疫治療等其他治療者；（2）嚴重心、肝、腎功能損害者；（3）患有精神疾病者；（4）患有除肝癌以外的其他惡性腫瘤者；（5）血清中丙型肝炎病毒陽性者：（6）血清中HBV陰性者。另選取在杭州市西溪醫院體檢的年齡相仿的健康體檢者20例作為健康對照組，其中男 16例，女 4例；年齡 22～81（41.70±10.03）歲。健康對照組納入標準：經實驗室檢驗、超聲檢查、CT檢查等輔助檢查排除惡性腫瘤、慢性內科疾病、傳染病等疾病史的健康人。兩組受試者性別和年齡比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經杭州市西溪醫院醫學倫理委員會審批通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 血清中lncBRM表達水平檢測 采用qRT-PCR法。分別收集57例HBV相關性肝癌患者和20例健康體檢者靜脈血5 ml（肝癌患者選擇術前1周內血清），3 000 r/min離心10 min，吸取血清至1.5 ml無酶離心管中，-80℃保存。應用血清RNA快速提取試劑盒從血清樣本中提取總RNA，分光光度計（Nano）檢測RNA純度及濃度。逆轉錄提取RNA，以RNAS18基因為內參，根據試劑盒的說明書進行qRT-PCR反應，計算血清中lncBRM的表達量。lncBRM、內參RNA S18的引物均由杭州艾迪康醫學檢驗中心實驗室合成并進行實驗，RNA快速提取試劑盒（批號：DP503）購自天根生物科技有限公司，反轉錄試劑盒（批號：FSQ-201）購自東洋紡生物科技有限公司，qRT-PCR兩步法試劑盒（批號：QPK-201）購自東洋紡生物科技有限公司。lncBRM上游引物：5'-GAGGAGAGAAGTCACTGAAATGG-3'，下游引物：5'-CTCTTCAAAGCAGACCCTCTAC-3'；RNA S18上游引物：5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'，下游引物：5'-TAGTA-GCGACGGGCGGTGTG-3'。。

1.3 觀察指標 統計HBV相關性肝癌患者性別、年齡、TNM 分期、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、有無肝外轉移、有無癌栓形成、有無血管侵犯、腫瘤直徑大小、腫瘤數目等臨床病理特征，并分析HBV相關性肝癌患者血清中lncBRM中表達水平與臨床病理特征的關系。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。lncBRM表達量以 M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線評估血清中lncBRM表達水平診斷HBV相關性肝癌患者的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清中lncBRM表達水平比較 肝癌組患者血清中 lncBRM 表達水平為[1.03（0.44，2.07）]×10-4，明顯高于健康對照組的[0.02（0.00，0.06）]×10-4，差異有統計學意義（Z=6.394，P＜0.01）。

2.2 HBV相關肝癌患者血清中lncBRM表達水平與臨床病理特征的關系 TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有癌栓形成、有血管侵犯、腫瘤直徑＞5 cm的HBV相關性肝癌患者血清中lncBRM表達水平分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ、無癌栓形成、無血管侵犯、腫瘤直徑≤5 cm的患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而血清中lncBRM表達水平與患者性別、年齡、AFP水平、有無肝外轉移、腫瘤數目均無關（均P＞0.05），見表1。

表1 HBV相關性肝癌患者血清中lncBRM表達水平與臨床病理特征的關系（×10-4）

2.3 血清中lncBRM表達水平診斷HBV相關性肝癌患者的效能 ROC曲線顯示血清中lncBRM表達水平診斷HBV相關性肝癌的AUC 為 0.983（95%CI：0.951～1.000，P＜0.01），Youden指數最大為0.932，最優截斷值為0.203×10-4，靈敏度為0.982，特異度為0.950。結果提示血清lncBRM表達水平對HBV相關性原發性肝癌具有較高的診斷價值，見圖1。

圖1 血清中lncBRM表達水平診斷HBV相關性肝癌的ROC曲線

3 討論

HBV相關性肝癌作為世界上最常見的惡性腫瘤之一[11]，其發病率呈穩步上升趨勢。多數HBV相關性肝癌早期缺乏特征性的臨床表現，確診時已為中晚期，從而導致治療效果不佳、預后極差[12]。血清AFP檢測是當前HBV相關性肝癌早期篩查最常用的檢查方法，但此方法不易發現早期微小癌灶，靈敏度不高易漏診[13]，無法滿足肝癌診斷尤其是早期診斷的臨床需要；超聲、CT等檢查對肝癌診斷具有重要的臨床價值，但是對于微小癌灶的診斷仍舊不足[14]。盡管超聲造影、增強CT、MRI對于微小癌灶的診斷具有一定優勢[15]，但目前不是臨床肝癌初篩的常規手段。近年來，lncRNA已被證實在許多生物過程中發揮重要作用[16]。因此，尋找早期診斷肝癌的lncRNA具有重要的臨床意義。

在腫瘤發生、轉移等細胞生物學進程中，lncRNA都是重要的表觀遺傳學調控因子[17]。Wang等[18]研究發現血清lncRNA-p21可作為HBV相關性肝癌患者肝細胞損傷的潛在生物標志物。一項納入820例HCC患者和785例健康者的Meta分析結果表明，血清lncRNA在肝癌診斷上具有較高的臨床價值。因此lncRNA可用于輔助診斷肝癌[19]。

CSCs是分化較差的癌細胞，具有與正常干細胞相似的特征，能夠生長、侵襲和再生，負責癌癥術后的復發和轉移[20-21]。而lncBRM能夠促進肝癌瘤體成型及CSCs增殖[22]。Zhu等[20]發現lncBRM敲除后成瘤能力最弱，結合本研究結果顯示肝癌組患者血清lncBRM表達水平明顯高于健康對照組，提示lncBRM可能參與了肝癌的發生、發展。另外，根據ROC曲線分析結果，血清中lncBRM表達水平對肝癌診斷具有一定的潛在價值。

綜上所述，本研究表明血清lncBRM對HBV相關性肝癌具有較好的臨床診斷價值，后續將進一步研究lncBRM是否能為肝癌術后的復發轉移提供新的治療靶點，能否作為HBV相關性肝癌患者預后判斷的客觀指標。