耐藥基因芯片技術對耐藥結核患者早期診治價值的研究

童涌 宋群 童照威

結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的傳染病。根據2019年12月全國法定傳染病疫情概況報道，我國結核病年發病數為82.3萬例[1]，僅次于印度、印度尼西亞，位居全球第三位[2]。根據2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告，分離菌株對11種抗MTB藥物的耐藥率為38.5%～42.7%[3]。其中異煙肼、利福平是抗結核治療中最重要的一線藥物，故對其進行耐藥性檢測具有重要臨床意義[4]。據報道，全球耐多藥結核患者有46萬例，而治療成功率僅為54%，病死率達16%[5]。因此，耐藥結核患者的早期快速診斷與及時治療是防治重點[6]。然而，由于MTB生長緩慢，采用傳統藥敏試驗檢測耗費時間較長，導致治療方案調整時機相對滯后[7]。耐藥基因芯片技術的出現，使得耐藥結核的早期快速診斷具有可能性。該檢測技術是目前MTB菌種分型和耐藥分子診斷的先進方法，能檢測患者痰液標本中是否含有MTB以及病原菌是否有利福平、異煙肼耐藥性相關基因rpoB/katG/inhA的基因突變（3個基因8個位點16種突變類型）。有學者應用該技術檢測了MTB和耐藥基因突變位點，且與高通量測序法具有很好的一致性[8]。本研究就耐藥基因芯片技術對耐藥結核患者早期診治的價值進行探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年6月至2020年12月湖州市中心醫院感染科結核病門診轄區內（吳興區、南潯區）登記的細菌學陽性患者882例為研究對象，其中耐藥基因芯片技術引入前（采用傳統藥敏試驗）308例，為對照組；耐藥基因芯片技術引入后（同時采用傳統藥敏試驗和耐藥基因芯片技術檢測）574例，為觀察組。對照組男 213 例，女 95 例；年齡 14～85（48.3±17.8）歲。觀察組男 420 例，女 154 例；年齡 15～93（51.1±19.1）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。入組標準：（1）治療開始時病原學確診為肺結核；（2）無難以控制感染；（3）血清 ALT、AST、TBil水平均在正常值上限的2倍以內；（4）血清絕對中性粒細胞計數≥1.5×109/L，PLT≥100×109/L；（5）血清肌酐、尿素氮均在正常范圍以內；（6）尿常規檢查結果正常；（7）心功能正常；（8）無不能耐受抗結核治療的其他情況。排除標準：（1）單純診斷為肺外結核；（2）合并嚴重的心、腦、肝、腎疾??；（3）拒絕參與臨床試驗研究；（4）肺結核病情嚴重且拒絕治療。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 （1）耐藥基因芯片技術檢測：采集患者痰液標本，使用北京博奧生物有限公司生產的晶芯LuxScan 10K/B微陣列芯片掃描儀、芯片洗干儀、芯片雜交儀、LuxScan通用微陣列圖像分析軟件、質控探針、DNA芯片及雜交試劑（規格：12人/盒，批號：20190801）進行檢測。①樣本處理：取2～3 ml痰液標本，加入10%氫氧化鈉液化30 min；吸取1 ml液化后溶液至1.5 ml的離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 ml 0.9%氯化鈉溶液振蕩；12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μl核酸提取液，混勻后轉移至核酸提取管中；然后置于核酸快速提取儀，最大轉速振蕩5 min，再將提取管置于95℃水浴5 min，10 000 r/min離心1 min，置于-20℃保存待檢。②樣本檢測：分別取18 μl樣本加入到3個PCR管中，每管加入2 μl核酸，上機擴增，產生擴增體系1、2、3產物；擴增產物95℃變性5 min，冰水浴3 min。第1個新PCR管加入擴增體系1產物3 μl+擴增體系2產物3 μl+雜交緩沖液9 μl，第2個新PCR管加入擴增體系1 產物 3 μl+擴增體系 3 產物 3 μl+雜交緩沖液 9 μl；混勻后各取13.5 μl雜交混合物加入芯片點陣中，體系1、2產物雜交加入到利福平耐藥，體系1、3產物雜交加入到異煙肼耐藥，蓋好盒蓋，金屬封條密封，運行芯片雜交程序。最后將完成雜交的芯片進行洗滌干燥，載入微陣列芯片掃描儀中自動進行結果判讀。（2）傳統藥敏試驗：采集患者痰液標本，使用改良羅氏培養基進行MTB培養，采用比例法檢測菌株的耐藥性。樣本用4%氫氧化鈉液化處理后接種至改良羅氏培養基，37℃恒溫培養箱培養至出現菌落后1～2周。菌液濃度為1 g/L，用0.9%氯化鈉溶液稀釋100、10 000倍，不同稀釋度菌液各0.01 ml分別接種至含藥培養基和空白培養基上，置于37℃恒溫培養箱4周后讀取結果。

1.2.2 觀察指標 觀察指標包括異煙肼及利福平耐藥檢出率、耐藥性反饋時間（藥物產生耐藥性所需要的時間）以及治療第2或6個月末臨床癥狀、影像學好轉及痰檢陰轉情況。按照肺結核診療規范的要求，兩組患者均采取初定方案（初治：2HRZE/10HR；復治：3HRZE/6HRE）進行治療，待傳統藥敏試驗或耐藥基因芯片技術檢測結果報告后及時調整治療方案。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異煙肼及利福平耐藥檢出率比較 觀察組（基因法）、觀察組（傳統法）、對照組（傳統法）患者異煙肼或利福平耐藥分別108、113、52例，其中異煙肼耐藥檢出率分別為18.5%、19.3%、16.6%，差異無統計學意義（P＞0.05）；利福平耐藥檢出率分別為7.5%、7.8%、8.7%，差異無統計學意義（P＞0.05）；異煙肼+利福平耐藥檢出率分別為7.1%、7.5%、8.4%，差異亦無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

表1 異煙肼及利福平耐藥檢出率比較[例（%）]

2.2 耐藥性反饋時間比較 觀察組（基因法）、觀察組（傳統法）、對照組（傳統法）耐藥性反饋時間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；經兩兩比較發現，觀察組（基因法）耐藥性反饋時間短于對照組（傳統法）、觀察組（傳統法）（均 P＜0.05），而觀察組（傳統法）與對照組（傳統法）耐藥性反饋時間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

表2 耐藥性反饋時間比較（d）

2.3 治療第2個月末臨床癥狀、影像學好轉及痰檢陰轉情況比較 治療第2個月末，觀察組（基因法）患者總體臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率均明顯高于對照組（傳統法），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。在單異煙肼耐藥患者中，觀察組（基因法）患者痰檢轉陰率明顯高于對照組（傳統法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉率、影像學好轉率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在單利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）與對照組（傳統法）患者臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在異煙肼+利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）患者臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率均明顯高于對照組（傳統法），差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 3。

表3 治療第2個月末臨床癥狀、影像學好轉及痰檢陰轉情況比較[例（%）]

2.4 治療第6個月末臨床癥狀、影像學好轉及痰檢轉陰情況比較 治療第6個月末，觀察組（基因法）與對照組（傳統法）患者總體臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。在單異煙肼耐藥患者中，觀察組（基因法）患者痰檢轉陰率明顯高于對照組（傳統法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉率、影像學好轉率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在單利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）與對照組（傳統法）患者臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在異煙肼+利福平耐藥患者中，觀察組（基因法）患者影像學好轉率明顯高于對照組（傳統法）（P＜0.05），而臨床癥狀好轉率、痰檢轉陰率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表4。

表4 治療第6個月末臨床癥狀、影像學好轉及痰檢陰轉情況比較[例（%）]

3 討論

耐藥結核的早期診斷較為困難，一直是結核病診療的難點。傳統的肺結核診斷方式主要依賴于痰涂片尋找MTB，雖然檢測時間較短，但靈敏度較低（僅20%），且不能檢測MTB藥敏情況；而傳統的藥敏試驗雖然能檢測MTB藥敏情況，但檢測所需時間較長[9]，導致耐藥結核患者不能得到及時的治療。然而，耐藥基因芯片技術能在短時間內獲得MTB感染及耐藥相關數據，具有較高的診斷及時性和準確性[10]。筆者前期研究發現，利用基因分子檢測技術能在治療第2個月末預測痰涂陽性患者5個月末的治療效果[11]?？梢姡R床上對耐藥結核患者進行早期診斷，將治療方案調整時機前移，可以讓患者得到及時、有效的抗結核治療。但是該研究僅僅停留在結核診斷方面，對耐藥結核患者干預研究的論證尚存在不足。因此，本研究從耐藥結核早期治療入手來探討耐藥基因芯片技術對耐藥結核患者早期診治的價值。

本研究結果顯示，在檢測一致性方面，耐藥基因芯片檢測與傳統藥敏試驗具有良好的一致性，但也存在部分異煙肼、利福平耐藥患者耐藥基因芯片技術未檢出但傳統藥敏試驗檢出耐藥的情況。筆者分析原因，發現觀察組（基因法）患者樣本經高通量測序顯示部分利福平耐藥基因rpoB 531（TCG-TAT）不常見突變存在，可能由于耐藥基因芯片技術本身僅針對單個菌落，而本研究是應用耐藥基因芯片技術直接檢測臨床痰標本中MTB耐藥基因，而樣本中含有抑制因子、菌量少或非結核菌DNA干擾等因素導致出現無法判讀的情況[12]。在耐藥性反饋時間方面，本研究發現耐藥基因芯片技術明顯優于傳統藥敏試驗（提早近42 d），而檢測結果的快速報告能為治療方案調整時間前移提供可能性。

那么，耐藥結核患者早期診斷與治療能否提高治療有效率呢？本研究結果顯示，治療第2個月末，觀察組（基因法）患者總體臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率均明顯高于對照組（傳統法），差異均有統計學意義。可見，耐藥基因芯片技術能使治療方案調整時間前移，使患者的治療效果優于對照組（傳統法）。但在治療第6個月末，兩組患者總體臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率比較，差異均無統計學意義；這是說明觀察組（基因法）總體治療效果未表現出明顯優勢，原因可能是對照組（傳統法）患者雖然治療方案調整時間滯后于觀察組（基因法），但是經過積極規范的治療后仍能取得良好的治療效果。在單異煙肼耐藥患者中，治療第2或6個月末，觀察組（基因法）患者痰檢轉陰率均明顯高于對照組（傳統法），而臨床癥狀好轉率、影像學好轉率比較差異均無統計學意義。這說明治療方案調整時間前移僅能提高單異煙肼耐藥患者的痰檢轉陰率，而對臨床癥狀及影像學好轉的影響不大，這可能是因為單異煙肼耐藥患者本身穩定性差，治療過程中部分患者對異煙肼仍然有效[10]，且利福平及其他藥物（除異煙肼外）仍然達到有效治療劑量。在單利福平耐藥患者中，治療第2或6個月末，觀察組（基因法）與對照組（傳統法）患者臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率比較，差異均無統計學意義。在異煙肼+利福平耐藥患者中，治療第2個月末，觀察組（基因法）患者臨床癥狀好轉率、影像學好轉率、痰檢轉陰率均明顯高于對照組（傳統法）；可能是因為對照組（傳統法）耐藥結核患者對異煙肼、利福平無效，僅使用乙胺丁醇、吡嗪酰胺等藥物不足以殺滅MTB，加上藥敏試驗報告時間長，導致治療方案調整滯后，使得2個月末治療效果較差。但在治療第6個月末，觀察組（基因法）患者影像學好轉率明顯高于對照組（傳統法），而臨床癥狀好轉率、痰檢轉陰率比較差異均無統計學意義?？紤]原因是對照組（傳統法）根據藥敏試驗結果及時調整治療方案，加上治療時間延長，因此在治療6個月末時仍能取得有效的治療效果。但是，耐藥基因芯片技術也有一定的局限性。有文獻報道與涂片鏡檢法比較，基因分子檢測技術可以提高結核病的診斷率，但不能降低治療6個月時的患者病死率，這說明及時的診斷與治療方案調整并不一定能提高患者的治療效果[13]。

綜上所述，耐藥基因芯片技術能提高耐藥結核的早期快速診斷，有利于治療方案調整時機前移，提高患者治療效果。