基于卟啉的糖識別探針

王佳昕， 賈冬民， 丁煜賓

（南京農業大學 化學系, 南京 210095）

糖類化合物在生物體內以多種形式存在，包括單糖、二糖、低聚糖、多糖、糖蛋白等，是生命活動的物質基礎之一。迄今為止，從單糖到分子量上萬的多糖，都在生命體系中扮演著各種重要的角色。血糖檢測是一項常規的檢查項目，通過血樣中葡萄糖濃度的測定，可知人體的糖代謝是否處于正常水平，這也是糖尿病人日常健康狀態監測的最重要依據。此外，一些活性多糖在臨床上也被廣泛使用，例如肝素就是一種手術和透析中不可或缺的抗凝血劑，其分子結構中最主要的重復單元是硫酸化的艾杜糖醛酸和氨基葡萄糖連接得到的二糖。針對特定糖類化合物發展高特異性、高靈敏的分析檢測和示蹤方法，對于相關疾病的診斷、治療和相關生命活動機制的研究具有重要的意義[1]。三明治結構免疫分析法[2]、電化學法[3]、比色法[4]、分子印跡法[5]、檢測試紙[6]和可穿戴的血糖檢測器[7]等新的檢測方法和檢測材料正在不斷地被開發出來，血糖檢測技術也因此不斷地被更新。

熒光分子探針一般是指結構中包含至少1 個熒光團的功能化有機分子。探針分子通過與待檢測目標物質發生特異性作用 (例如配位、氫鍵、共價鍵斷裂與形成等)，使其化學結構或者聚集狀態發生改變，從而產生光學信號。分子探針技術可以將分子界面的相互作用信息以光學信號的形式直觀地傳遞給觀察者，具有響應速度快、靈敏度高、原位檢測和對樣品無損等優點，因此被廣泛關注并用于各種生物分子、離子、核酸、蛋白酶等生物大分子的生物成像和檢測[8-10]。針對糖類化合物的識別，分子探針在設計過程中可以通過引入糖捕獲空腔 (模擬凝集素)[11-14]、硼酸作用位點[15]、糖靶向多肽[16]等方法提高探針分子對糖的特異性結合能力，或者設計構建熒光傳感陣列[17]實現對糖的模式識別[18]。此類分子探針所涉及的熒光傳感機制包括振動誘導發光[19]、聚集誘導發光[20]等，近幾年一些相關的綜述對其進行了詳細的介紹[21-22]。

卟啉被稱之為“生命色素”，在植物的光合作用和動物的呼吸作用中不可或缺，肩負能量傳遞和物質轉移等重任[23]。自然界之所以會選擇卟啉，這取決于卟啉優異的光物理和光化學性質。大部分卟啉類化合物化學性質穩定，其四吡咯芳香大環的核心結構對酸、堿、熱并不敏感，保障其在應用中不易分解。此外，卟啉類化合物摩爾消光系數大，吸收光譜中的Soret 帶和Q 帶波長范圍寬，覆蓋了大部分的可見光光區至部分近紅外光區。而且延長共軛體系的卟啉結構甚至可以吸收2 000 nm 以上波長的光波[24]。卟啉類化合物的熒光發射波長也一般都在600 nm 以上，通過共軛體系的延長或者發展擴展卟啉，該類化合物的熒光很容易達到近紅外區域，為其應用于生物體系創造了優越的條件[25]。結合作者自身在卟啉和糖識別領域的研究經歷[26-29]，綜合考慮文獻中所檢測糖的種類、探針的物質構成和探針的識別單元3 個因素，嘗試從基于卟啉的特異性單糖探針 (芳基硼酸識別單元)、基于卟啉的特異性單糖探針 (其他識別單元)、卟啉-無機納米復合物用于葡萄糖檢測 (也屬于單糖探針，探針物質構成為有機-無機雜化材料) 和基于卟啉的多糖探針4 個方面對卟啉類探針在糖識別領域的研究現狀進行簡明扼要的總結，并在文末對該領域未來可能的發展趨勢進行展望。

1 基于卟啉的特異性單糖探針：芳基硼酸識別單元

日本化學家新海征治(Seiji Shinkai)課題組在發展糖識別傳感器領域做出了很多杰出的、開創性的研究工作。其分子設計主要圍繞卟啉的meso-位修飾芳基硼酸單元，利用芳基硼酸對糖分子中二醇單元的強結合能力，將其作為糖的識別位點[30]。如通過將含有1 個芳基硼酸取代基的卟啉化合物1(見圖1)與只含有4 個醇羥基的單糖包括D/L-海藻糖、D-阿拉伯糖、甲基-α-D-甘露糖苷和D/L-蘇糖醇在二氯甲烷中回流，可以得到對應的以1:2 結合的單糖-卟啉硼配合物[31]。理論計算表明，該反應所得的海藻糖-卟啉、阿拉伯糖-卟啉、甲基-α-D-甘露糖苷-卟啉和蘇糖醇-卟啉配合物中，2 個卟啉環平面之間的夾角分別為120°、53°、40°和12°，因此該反應實現了對2 個卟啉分子之間距離和角度的有效調控。并且來源于不同D/L 構型糖的卟啉配合物展現出完全不同的光譜，可以用于糖D/L 構型的區分。

圖1 卟啉探針1 的化學結構及其與不同單糖的結合模式[31]Fig. 1 Chemical structure of porphyrin-based sensor 1 and its binding modes with different sugars[31]

事實上，新海征治課題組在早期的研究中發現芳基硼酸修飾的卟啉分子 2 (見圖2) 在DMSOH2O (1∶30,V∶V) 體系中對D-果糖具有明顯的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜響應，且對D-果糖的響應信號大于阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，對D-果糖的檢測限為0.5 mmol/L[32]。可能的光譜響應機制在于2 結合D-果糖后分子的聚集狀態發生了改變。基于相同的原理，該課題組又在2 的基礎上發展了相應的金屬卟啉硼酸探針分子 3M2+(見圖2，M2+= Mg2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+)，其與D-果糖結合后由幾乎無熒光的聚集狀態改變為分散的單體狀態，從而熒光恢復，同時溶液的顏色也發生了肉眼可見的變化[33]。

在單一的硼酸-糖作用基礎上，新海征治課題組又設計合成了含芳基硼酸基團的鋅卟啉化合物4(見圖2)[34]。通過其硼酸單元與糖分子中的1,2-二醇單元結合，同時其大環中心的鋅離子與磷酸單元配位，化合物4 可以非常好地識別葡萄糖-6-磷酸，而對葡萄糖-1-磷酸響應微弱。基于這種雙位點識別作用，化合物4 還被用于生物活性物質多巴 (3,4-二羥基苯丙氨酸，多巴胺的上級原料) 及其衍生物的分析檢測。出于類似的雙識別位點思想，該課題組還曾在芳基硼酸鋅卟啉的軸向通過配位引入第2 個芳基硼酸單元，設計合成了包含位于卟啉邊緣和軸向2 個位置的雙芳基硼酸糖探針5[35]。而如果將2 個芳基硼酸單元分別修飾在卟啉的2 個meso-位，并在苯環與卟啉環之間引入1 個炔基以減小苯環旋轉時受到的卟啉環位阻，則所獲得的分子如鋅卟啉6 中的2 個芳基硼酸單元可以通過苯環的旋轉而改變彼此之間的距離，從而實現對不同尺寸糖類化合物的識別[36]。基于這種雙芳基硼酸識別位點與糖二醇單元的作用機制，卟啉探針還被Hargrove 等[37]用于人參皂苷的識別。

除了以上單卟啉結構的糖硼酸探針設計，新海征治等還將鐵卟啉7 在pH=10.5 的條件下反應獲得了1 個鐵卟啉二聚體8(如圖3 所示)[38]，該化合物被作者稱之為“糖鑷”。鐵卟啉二聚體8 分子中糖的識別位點仍然為芳基硼酸單元，但比較特別的是該分子中2 個卟啉環之間的距離與單糖的分子尺寸比較接近，使得8 對葡萄糖和半乳糖具有非常高的選擇性。實驗表明，雖然8 含有8 個芳基硼酸單元，但其與葡萄糖或半乳糖結合僅用到其中的2個芳基硼酸單元，其與糖結合的化學計量比為1:1。此外，8 與葡萄糖在僅含 0.3% 甲醇的pH=10.5 的碳酸緩沖溶液中的結合常數達到1.51×105(mol·L–1)–1，與半乳糖的結合常數為2.43×104(mol·L–1)–1，已經接近相應糖特異性蛋白酶的結合能力。從這個例子中我們可以看到，為了提高探針分子對目標單糖的結合能力，合理地通過調控不同芳基硼酸單元之間的空間距離來進行分子結構設計，對探針分子的高結合常數和高選擇性具有至關重要的影響。

圖3 鐵卟啉二聚體 8 的制備及其糖識別原理[38]Fig. 3 Synthesis of iron porphyrin dimmer 8 and its sugar binding mode[38]

2 基于卟啉的特異性單糖探針：其他識別單元

除了比較經典的芳基硼酸識別位點，膽汁酸[39]、多羧酸/多酰胺[40]、環狀多肽[41]等結構也常常被用于設計糖識別單元。在糖識別單元的設計中，如何合理地調控探針分子與糖之間的氫鍵作用，對于提高探針對目標單糖的選擇性具有至關重要的作用。例如將聯苯結構凝集素模擬受體分子上的橋連基團由間苯二甲酰胺單元替換為2,5-二氨甲基吡咯單元之后，所得新的凝集素模擬受體分子 (見圖4(a)) 對葡萄糖的結合能力是間苯二甲酰胺單元對應受體的2 倍，這是由于2,5-二氨甲基吡咯單元橋連受體分子中間吡咯環上N—H 鍵的引入改變了受體與糖的氫鍵作用模式[42]。糖識別單元的設計除了考慮與糖分子中醇羥基的氫鍵作用之外，還包括探針中的芳環部分與糖分子中 C—H 鍵之間的 C—H…π 作用[43]。例如將長碳鏈以及 L 型的纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸通過碳酰胺基團修飾在四苯基卟啉分子的苯環上，所得4 個化合物 9a～d (見圖4(b)) 或者其對應的鋅卟啉對半乳糖苷、葡萄糖苷、甘露糖苷在二氯甲烷溶液中的結合常數可以達到 104～105(mol·L–1)–1級[44]。此外，疏水作用的引入也可能影響糖探針的識別能力，例如將含有醛基的甾族化合物與吡咯作為原料合成的4 個 meso-位被甾族化合物結構修飾的卟啉分子10 (見圖4(b))[45]。卟啉分子10 中的甾族結構部分作為糖的識別位點，通過氫鍵和疏水作用與糖分子結合，而卟啉作為信號報告單元。Job plot 數據表明 10 與 D-葡萄糖以 1:2 的化學計量比結合，在水-異丙醇 (1∶1,V∶V) 的混合溶液中的結合常數可達 1.2×109(mol·L–1)–2，作用過程使得卟啉溶液的紫外-可見吸收光譜發生顯著的變化。但需要指出的是，卟啉類糖探針對糖的光譜響應信號有時候并非來源于卟啉-糖配合物的形成 (化學變化)，也可能是糖的加入改變了卟啉分子的聚集態 (物理變化)[46]。此外，雖然基于C—H…π 作用、氫鍵作用和疏水作用的卟啉類探針也能夠獲得與基于芳基硼酸識別單元的卟啉探針相當的單糖識別性能，但是這類探針與糖分子的作用機制顯然更為復雜。

圖4 (a) 基于聯苯結構的人工凝集素模擬受體與葡萄糖的結合模式；(b) 探針 9a～d 和 10 的結構[44-45]Fig. 4 (a) Proposed binding mode between biphenyl-based synthetic lectin and glucose, (b)structures of sensors 9a-d and 10[44-45]

3 卟啉-無機納米復合物：葡萄糖檢測

將卟啉與無機納米材料結合，利用卟啉特殊的電子和能量傳遞性能可望賦予相應的納米復合材料新的化學特性[47-50]。在這方面，卟啉可以很方便地以單體的形式直接修飾在無機納米材料表面，從而實現對原無機納米材料的改性。如 Fe3O4納米顆粒本身的類過氧化物酶催化活性較低，將四(4-羧基苯基)卟啉 (H2TCPP) 修飾在 Fe3O4納米顆粒表面后發現所制備的 H2TCPP-Fe3O4納米復合物模擬過氧化物酶的催化反應活性大大提高，可以高效地催化雙氧水氧化無色的 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺 (TMB) 底物至藍色氧化態，從而通過比色法實現對雙氧水的檢測[51]。再結合葡萄糖氧化酶特異性催化氧化葡萄糖至葡萄糖酸并釋放雙氧水這一上級反應，H2TCPP-Fe3O4納米復合物可以通過對所生成雙氧水的檢測間接實現對葡萄糖的特異性定量分析。該方法對葡萄糖的檢測限為 2.21×10–6mol·L–1，線性響應范圍為 5×10–6～ 2.5×10–5mol·L–1。該論文所設計的復合物探針具有易于制備、靈敏度高的優點。

除了直接以單體形式修飾在無機納米材料表面，卟啉自身也可以組裝成具有媲美辣根過氧化物酶活性的納米催化材料。Fan 等[52]將四(4-吡啶基)鐵卟啉 (Fe-TpyP) 與1,6-二溴正己烷反應，組裝得到了球狀的納米膠囊 Fe-TpyP NCs (Fe-TpyP nanocapsules)。該膠囊殼層的厚度僅約1 nm，并且暴露出多個催化反應位點，能夠很好地模擬過氧化物酶催化雙氧水氧化無色的TMB(3,3′,5,5′ -四甲基聯苯胺)底物至藍色的氧化態(見圖5)。將此納米膠囊模擬酶同樣與葡萄糖氧化酶結合可以構建串聯反應體系用于葡萄糖檢測。該體系首先通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖為葡萄糖酸并產生雙氧水，隨后Fe-TpyP NCs 再催化雙氧水氧化 TMB為藍色氧化態，通過TMB 氧化顯色的傳感機制，納米膠囊 Fe-TpyP NCs 被成功用于對葡萄糖的選擇性檢測，檢測限為0.098×10–6mol·L–1。

圖5 基于Fe-TpyP NCs 和葡萄糖氧化酶的葡萄糖檢測體系[52]Fig. 5 Glucose sensor achieved by combining GOX and Fe-TPyP NCs[52]

此外，將卟啉合成金屬有機框架、納米片、納米球等材料之后再與無機納米材料進行復合也可以獲取新的葡萄糖傳感方法。例如用硼氫化鈉將硝酸銀還原成銀納米顆粒 (AgNPs)，使之吸附在四(4-羧基苯基)卟啉-鋯金屬有機框架 (PCN-224)表面，得到無熒光的 AgNPs-PCN-224 納米復合物用于熒光檢測葡萄糖[53]。當葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化時，所產生的雙氧水將銀納米顆粒氧化成銀離子，使之從 PCN-224 表面釋放，從而使 PCN-224 被銀納米顆粒淬滅的熒光得到恢復。因此，AgNPs-PCN-224 納米復合物能夠以熒光增強的信號檢測葡萄糖，并被成功用于血樣中的葡萄糖檢測。該體系利用了卟啉金屬有機框架的熒光性能，可以高選擇性地檢測最低 0.078 ×10–6mol·L–1的葡萄糖。

再如將金納米顆粒 (AuNPs) 修飾到二維銅-四(4-羧基苯基)鐵卟啉金屬有機框架 (Cu-TCPP(Fe)) 表面制備 AuNPs-Cu-TCPP(Fe) 復合納米片用于表面增強拉曼光譜檢測葡萄糖[54]。在AuNPs-Cu-TCPP(Fe) 復合納米片的設計中，Cu-TCPP(Fe) 部分具有過氧化物酶催化活性，而AuNPs 具有類葡萄糖氧化酶催化活性，因此該復合納米片的設計直接完成了類葡萄糖氧化酶與類過氧化物酶催化反應的串聯，避免了對天然葡萄糖氧化酶的依賴。此外，Cu-TCPP(Fe) 表面的AuNPs 在設計中還扮演了表面增強拉曼光譜信號基底的角色，起到了信號放大的作用。該體系被成功用于檢測唾液樣品中的葡萄糖含量。

4 基于卟啉的多糖探針

阿卡波糖 (Acarbose) 的化學結構中含有4 個糖單元，屬于低聚糖。該糖是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，能夠減緩腸道對葡萄糖的吸收，從而起到降血糖的作用，因此在臨床上被用于治療II 型糖尿病。Fukuhara 等[55]和 Sasaki 等[56]將卟啉通過酯鍵與凝膠多糖糖鏈的6C 位羥基偶聯，設計合成了卟啉-凝膠多糖探針分子 (Por-Cur) 用于阿卡波糖的分析檢測 (見圖6)。卟啉-凝膠多糖探針分子 Por-Cur 在二甲基亞砜中呈隨機纏繞狀態，而在含水體系中則形成球狀，使得卟啉分子構象較為固定并在生物檢測有效光譜區域發出圓二色信號[55-56]。阿卡波糖的出現會使得水溶液中球狀的卟啉-凝膠多糖分子重新形成包含阿卡波糖在內的共同聚集體，從而產生圓二色信號。該探針對阿卡波糖的檢測限可以達到 200×10–6mol·L–1。

圖6 阿卡波糖和卟啉-凝膠多糖探針 Por-Cur 的結構[55-56]Fig. 6 Chemical structures of acarbose and sensor Por-Cur[55-56]

糖胺聚糖又稱粘多糖，在高等動物的結締組織中廣泛存在，大多具有多樣的生物活性。其中肝素具有顯著的抗凝血活性，被廣泛用于臨床的手術和透析過程中，也被用于心血管疾病的治療。硫酸軟骨素被用于治療骨關節炎和膀胱炎。還有如透明質酸在護膚產品和眼科手術中常常被使用。這些不同的糖胺聚糖化學結構復雜，其在生物合成的過程中缺乏像核酸引導蛋白質合成那樣的“中心法則”，使得每種糖胺聚糖的化學結構具有明顯的異質性。此外，不同糖胺聚糖主要二糖重復單元的化學結構又具有一定相似性。這使得準確識別不同的糖胺聚糖成為分析化學領域的難題之一。

為了解決糖胺聚糖結構異質性所帶來的缺乏特異性識別位點的問題，模式識別提供了全新的解決方案[57-60]。與特異性識別方法不同，模式識別通過模擬人體嗅覺和味覺系統的工作原理，通過綜合多個交叉響應性傳感器的檢測信號，經過數據統計分析得到對每個相似分析物的特定模式，從而完成檢測。這方面，本課題組近期設計合成了5 種帶有不同數量和位置甲基化吡啶單元的卟啉，并將它們組裝到氧化石墨烯的表面得到對應的無熒光納米復合材料，構建了卟啉-氧化石墨烯傳感陣列PPGO (見圖7)[61]。該陣列通過卟啉被不同糖胺聚糖競爭性取代而表現出熒光增強，得到糖胺聚糖的特異性指紋圖譜。線性判別分析顯示該傳感陣列能夠在 PBS 和 10% 血清中高準確性地檢測肝素，并可以檢測肝素中微量的常見糖胺聚糖雜質。

圖7 PP-GO 陣列傳感器的工作原理[61]Fig. 7 Working principle of the PP-GO sensor array[61]

最近，本課題組又分別以帶負電的1-芘丁酸(Py) 為能量給體，3 種帶正電的甲基化吡啶取代卟啉為能量受體，構建了3 個超分子配合物 Py-PP1,Py-PP2 和 Py-PP4[62]。研究表明，由于3 種配合物中的卟啉單元修飾有不同數量和位置的甲基化吡啶取代基，Py-PP1, Py-PP2 和 Py-PP4 對不同糖胺聚糖表現出差異性的比率熒光響應(見圖8)。以Py-PP1, Py-PP2 和 Py-PP4 為傳感單元構建的比率型熒光陣列傳感器可以在 10% 的血樣中準確鑒別肝素、硫酸軟骨素、透明質酸和硫酸葡聚糖，并可以檢測肝素樣品中微量(0.1%) 的糖胺聚糖雜質。值得指出的是，該比率型熒光陣列傳感器對4種常見糖胺聚糖的鑒別甚至可以通過肉眼直接判斷(如圖8 所示)。

圖8 Py-PP 陣列傳感器對糖胺聚糖的可視化模式識別[62]Fig. 8 Fluorescence pattern recognition of different GAGs using the Py-PP sensor array[62]

5 結 語

從基于芳基硼酸識別單元的卟啉類單糖探針、基于其他識別單元的卟啉類單糖探針、用于葡萄糖檢測的卟啉-無機納米復合物和基于卟啉的多糖探針4 個方面介紹了卟啉這一特殊熒光團在設計糖識別探針領域的研究現狀。可以看出，目前國內外關于卟啉類糖識別探針的研究尚十分有限。事實上，即使是目前研究最廣泛、深入的葡萄糖檢測技術，很大程度上仍然依賴葡萄糖氧化酶或者其模擬酶的參與。鑒于不同糖類化合物化學結構的復雜性和相似性，如何從分子層面上理性設計高效的糖識別探針具有較大難度。卟啉化學性質穩定、光物理性能優異，相信發展基于卟啉的糖識別探針仍然大有可為。這方面，卟啉的大π 體系可以通過C—H…π 作用識別單糖，而其吡咯NH 也可以與糖羥基形成氫鍵。此外，卟啉的4 個meso-位還可以修飾相應識別單元，為進一步調控探針與糖分子之間的結合能力提供了可能。如果再將卟啉結合其他小芳香環設計合成空間大小合適的空腔來模擬凝集素，或可以綜合以上多種作用來識別糖分子，獲得性能優異的新一代糖識別探針。