凍融作用對石油烴與鎘復合污染土壤修復植物生理特性的影響

王晶晶， 吝美霞， 趙琦慧， 李法云， 王 瑋， 周純亮

（1. 遼寧大學 環境學院, 沈陽110036；2. 上海應用技術大學 生態技術與工程學院, 上海 201418；3. 湖南農業大學 資源環境學院, 長沙 410128；4. 上海城市路域生態工程技術研究中心, 上海 201418；5. 美麗中國與生態文明研究院 上海高校智庫, 上海 201418）

遼河油田是我國第三大油田、目前每年原油開采能力超過1×107t，天然氣開采能力達到8×108m3。在石油開采過程中，由于含鹽泥漿、含油廢水、殘油渣和油泥等逐漸進入土壤，井場附近土壤的石油污染成為了油田開采區亟待解決的環境問題[1-2]。

石油烴-重金屬復合污染土壤也日漸引起了國內外學者的高度重視[3]。研究表明，不同年代開發的油井周圍土壤中重金屬有效態和全量隨著油井運行時間的增長呈現增高的趨勢[4]。原油和鉆井液中含有的重金屬及油田開采區農業生產中化肥的施用，常導致土壤重金屬濃度提高，致使油田開采區土壤呈現石油烴和重金屬復合污染特征[3]。土壤中有機污染物和重金屬復合污染的交互作用常會產生不同的環境行為和環境效應[5]。目前，有機-重金屬復合污染的研究主要集中在農藥、有機鰲合劑、石油烴及芳香類化合物與重金屬之間的復合污染。石油生產、運輸和應用，農業機具清洗或泄漏等途徑都會產生石油烴與重金屬復合污染。

鑒于我國寒冷區域油田分布較多且凍融存在的典型特征，結合植物修復研究凍融對石油烴與重金屬復合污染的影響至關重要。冰凍是作用于土壤微生物菌群的一個主要的非生物應力[6]。凍融作用可使土壤的物理、化學和生物學性質發生明顯的變化，如使土壤疏松度增加、水穩性團聚體降低，可促進有機物質和細菌的接觸及增強酶的激活效應，加強有機物質的礦化作用速度[7]。我國東北地區冬春季的凍融作用是導致土壤物理、化學和生物性質發生變化的重要環境因子。凍融作用發生的時間、次數將顯著影響微生物對有機污染土壤的生物修復過程[8]。在凍融作用研究方面，我國學者主要集中于水鹽動態過程、系統與環境間的能量交換、全球變化條件下的凍土變化響應模型、凍土的改造與利用等方面[9]，開展凍融作用對寒冷地區油田開采區石油烴污染土壤的生物修復研究，具有重要的實際意義。

為了闡明凍融作用對石油烴與重金屬復合污染土壤植物修復的影響，本研究采用凍融與非凍融土壤盆栽模擬試驗，分析使用石油烴和典型重金屬Cd 污染土壤栽培艾蒿(Artemisia vulgarisL.)和紫花苜蓿(Medicago sativaL. )的生理特性與土壤植物修復效率，評價不同類型污染對供試植物生長發育的影響及不同植物對污染物的降解效果，以期為寒冷地區石油烴與重金屬復合污染土壤植物修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

供試土壤采自遼河油田金馬油田開發公司采油作業第二區，該地區冬季平均氣溫為-7.6 ℃，歷史最低日氣溫-29.3 ℃，1 月份氣溫最低，月平均氣溫為-10.2 ℃，土壤一般在11 月上旬開始結凍，下旬封凍。采油磕頭機(編號#2422)的開采年份為1992 年。在距離此磕頭機10 m 的土壤裸露處，采集3 點土樣；再在距離此磕頭機20 m 的周圍農田交界處，植物覆蓋茂盛位置，采集3 點土樣。剝去表層覆蓋物后，采樣深度約為10～30 cm。將6 點土樣進行混合。采樣當天將土樣帶回實驗室，經碾碎混勻后，過1 mm 篩，裝入試劑袋密封，放入冰箱4 ℃保存備用。對照清潔土壤采自附近未受石油污染的農田，其方法同上。

此石油烴污染土壤采自油井附近，其總石油烴(total petroleum hydrocarbons, TPHs)含量為14 015.22 mg·kg–1(見表1)，約為國家農業標準[10]臨界值500 mg·kg–1的28.0 倍，說明此土壤受石油烴污染情況較為嚴重。

表1 采樣點土壤基本性狀Tab. 1 Basic characteristics of sampled soil

1.2 土壤樣品凍融處理

土壤的凍融循環處理方法如下。模擬凍結溫度為遼河油田1 月份月平均氣溫(–10.2 ℃)。將土樣置于(–10±0.4) ℃低溫培養箱中，在低溫條件下冷凍2 d，然后將其轉移到(4.0±0.4) ℃恒溫培養箱中培養1 d，使其解凍，此為1 個凍融循環。重復此循環6 次。恒溫處理土壤保存在4 ℃培養箱中。土壤凍融循環處理結束后，對土壤樣品立即進行土壤性質測定。

供試土壤制備方法如下。①對照處理：未受石油污染土壤僅進行恒溫處理。②Cd 污染土壤處理：未受石油污染土壤先進行恒溫處理，再添加含20 mg Cd2+的水溶液，烘干土重記準確質量。 ③TPHs污染土壤處理：TPHs 污染土壤進行凍融循環和恒溫2 個處理。④TPHs 和重金屬Cd 復合污染土壤處理：在前述TPHs 污染土壤中繼續添加含20 mg Cd2+的水溶液，烘干土重記準確質量，然后繼續進行凍融循環和恒溫2 個處理。

2 種供試植物分別為艾蒿(Artemisia vulgarisL.)和紫花苜蓿(Medicago sativaL.)，種子購置于河南省神農種植園公司。

1.3 盆栽試驗

分別將對照土壤、Cd 污染土壤、石油烴污染土壤及Cd 和石油烴復合污染土壤4 種供試土樣經自然風干、搗碎、剔除雜物后過2 mm 篩。在每個塑料盆(13 cm×10 cm)中裝入試驗土壤1 kg，按盆栽作物對養分的需求(N 元素200 mg·kg–1、P2O5100 mg·kg–1、K2O 150～200 mg·kg–1)，分別加入在土壤中加入尿素、磷酸二氫鉀、硫酸鉀400、200、300 mg·kg–1，噴施清水至土壤最大飽和持水量，平衡7 d。

選取大小均勻飽滿的艾蒿和紫花苜蓿種子在5%的次氯酸鉀溶液中浸泡10 min，用去離子水沖洗數次后再用蒸餾水清洗，然后將其浸泡在40～50 ℃蒸餾水中30 min。土壤裝盆后澆水至土壤最大飽和持水量，平衡7 d，將處理后的種子撒于其上，此后保證每次澆水達到田間持水量的70%。

采集長勢良好、大小一致的艾蒿和紫花苜蓿，用蒸餾水洗凈其根系上黏附的土壤和雜質，分別于每盆中移栽3 株艾蒿，移栽4 株紫花苜蓿。室內培養溫度為18～23 ℃。為了保證各個試驗盆缽采光的一致性，每周交換1 次盆缽的放置位置；同時，為了保證各盆缽的土壤含水量的一致性，試驗期間定期澆水，保持70%的田間持水量。植物修復時間從8 月7 日至10 月21 日，生長75 d 后測定其葉綠素含量、葉片質膜相對透性、光合作用和重金屬蓄積含量。每個處理濃度設3 個重復，試驗結果為3 次測定結果的平均值。

將植物與土壤分離，用蒸餾水洗滌植物根部，保留完整的植物葉片以供分析測試；土壤經晾干，粉碎均勻，過篩，取土壤樣品(干重50 g)，用于后續分析測試使用。

1.4 分析測試

(1) 葉綠素含量的測定：葉綠體色素含量采用乙醇丙酮混合液浸提法提取，用分光光度法測定。

(2) 葉片質膜相對透性的測定：用改進的電導率法測定葉片組織外滲液電導率的變化，以此反映質膜受損傷的程度。

(3) 光合作用的測定：分別選擇不同栽培的艾蒿和紫花苜蓿，生長健康、長勢一致、照光均一的同一葉位(從頂部向下第1 片完全展開葉)葉片的中間小葉，于上午9:00～11:30 采用Li-6 400 便攜式光合測定系統(LI-COR Inc，USA)進行光合參數的測定。凈光合速率(Pn)、細胞間隙CO2濃度(Ci)由光合測定系統直接讀出。

(4) 土壤酶活性測定：采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性；采用靛酚藍比色法測定脲酶活性；采用分光光度法測定脂肪酶活性[11]。

(5) 重金屬蓄積含量：采用原子吸收分光光度計測定Cd 含量[12]。

(6) TPHs：采用超聲-萃取重量法測定土壤TPHs 含量[13]。

(7) pH：稱取待測土樣 10 g 放在 50 mL 的燒杯中，加入25 g 蒸餾水，置于磁力攪拌器上攪動1 min，靜置30 min 后用pH 計測定。

2 結果與討論

2.1 凍融作用對石油烴污染土壤理化性質的影響

凍融處理對土壤理化指標變化的影響如表2所示。經6 個凍融循環共18 d 的凍融處理后，土壤水分質量分數上升，pH 下降，過氧化氫酶活性高于恒溫處理土壤，脲酶活性與凍融前相比也有所提高，脂肪酶活性下降。凍融處理土壤石油烴降解率為29.22%，而恒溫處理僅為23.86%，凍融作用一定程度上提高了污染土壤的石油烴降解效率，可為后期植物修復營造較好的土壤生物環境[7，14]。

表2 凍融處理對土壤理化指標的變化特征影響Tab. 2 Effects of freezing-thawing treatment on soil physical and chemical properties

2.2 石油烴與Cd 脅迫對植物生理特性的影響

2.2.1 植物葉片質膜相對電導率變化

植物葉細胞相對電導率是衡量質膜相對透性的指標之一，葉片組織外滲液電導率的變化能夠反映質膜受損傷的程度。如圖1 所示，各處理在相同污染條件下，艾蒿的相對電導率都高于紫花苜蓿，但與對照處理相比，艾蒿相對電導率的增加率卻均遠小于紫花苜蓿。石油烴和重金屬Cd 復合污染作用下，2 種供試植物相對電導率顯著高于單一污染處理，說明石油烴和重金屬復合污染對植物葉片細胞膜的傷害大于單一污染作用。石油烴與重金屬Cd 復合污染土壤恒溫處理與對照處理相比較，艾蒿相對電導率增加了294.03%，而紫花苜蓿則增加了521.96%，說明復合污染對紫花苜蓿葉片細胞膜受害程度更大。這一現象與艾蒿滿足Cd 超富集植物特征，對Cd 耐脅迫能力強有關[15]。

圖1 石油烴與Cd 脅迫對植物葉片相對電導率的影響Fig. 1 Effect of petroleum hydrocarbon and cadmium stress on relative conductivity of plant leaves

2.2.2 植物葉片葉綠素含量變化

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，葉綠素含量高低決定植物光合作用水平。葉綠素總量的變化通常與葉片的生理活性、植物對環境的適應性和抗逆性有關，是衡量葉片衰老的重要生理指標，也可以作為評價植物抗污染脅迫的一個重要指標[16]。研究表明，Cd 是一種強親巰基(—SH)的重金屬元素， Cd 進入植物葉綠體后，可以與植物體內蛋白質上的空白巰基結合，或取代已與巰基結合位置上的Fe2+、Zn2+和Mg2+，破壞葉綠體的結構和功能。即使環境中含有較低濃度的Cd，也會影響植物的養分吸收、光合作用，使植物體內代謝過程紊亂，生長發育受到抑制[17]。

石油與Cd 脅迫對植物葉綠素總量的影響如圖2 所示，不同處理條件下紫花苜蓿葉片總葉綠素含量均高于艾蒿，且表現出對照土壤＞Cd 污染土壤＞石油烴污染土壤＞石油烴與重金屬Cd 復合污染土壤的現象，這說明石油烴與Cd 復合污染對植物的脅迫作用大于單一污染。2 種污染土壤的凍融處理葉綠素含量都略大于恒溫處理，但差異未達到顯著水平，這可能是由于凍融處理雖然能改變土壤理化和生物性質，但上述改變尚不足以導致供試植物光合作用發生顯著性變化。

圖2 石油烴與Cd 脅迫對植物葉綠素總量的影響Fig. 2 Effect of petroleum hydrocarbon and cadmium stress on total chlorophyll in plants

試驗發現，石油烴與Cd 復合污染土壤恒溫處理與對照組相比，艾蒿和紫花苜蓿葉綠素含量分別下降23.00%和36.23%，隨著污染程度的增強，艾蒿總葉綠素含量降低幅度較為平緩，紫花苜蓿則降幅較大，說明紫花苜蓿受污染脅迫傷害較嚴重。對2 種供試植物的葉表觀形態觀察表明，隨著污染脅迫程度的加強，艾蒿與紫花苜蓿葉片顏色由深變淺，表現出輕微的缺綠癥狀。在復合污染條件下植物受害癥狀明顯，植株矮小，葉面積顯著降低，其中紫花苜蓿表觀受害癥狀變化比艾蒿更為明顯，可見石油和重金屬Cd 單一及復合污染條件下，艾蒿抗污染脅迫的性能高于紫花苜蓿，這與課題組前期對植物吸收重金屬的研究相吻合[18]。

2.2.3 植物葉片凈光合速率變化

植物凈光合速率反映植物的光合潛能，對植物光合作用的測定可以表征植物生長發育的狀況, 重金屬Cd 能抑制光合循環中的相關酶[19]。

石油烴與Cd 脅迫對植物凈光合速率和胞間CO2濃度的影響如圖3 和圖4 所示。艾蒿和紫花苜蓿的凈光合速率Pn從大到小表現為：對照組＞石油烴或重金屬Cd 單一污染＞石油烴和重金屬Cd 復合污染；植物胞間CO2濃度Ci則表現為對照組＜石油烴或重金屬Cd 單一污染＜石油烴和重金屬Cd 復合污染。艾蒿的凈光合速率雖然小于紫花苜蓿，但是對于Cd、石油烴及其復合污染土壤經凍融處理后，艾蒿受污染脅迫時凈光合速率的下降幅度小于紫花苜蓿。

圖3 石油烴與Cd 脅迫對植物凈光合速率的影響Fig. 3 Effect of petroleum hydrocarbon and cadmium stress on net photosynthetic rate of plants

圖4 石油烴與Cd 脅迫對植物胞間CO2 濃度的影響Fig. 4 Effect of petroleum hydrocarbon and cadmium stress on plant intercellular CO2 concentration

逆境脅迫下，引起植物葉片光合速率降低的植物自身因素主要有2 種：一是受氣孔導度影響的氣孔限制；二是受葉肉細胞光合活性的下降影響的非氣孔限制。Ci值的大小是評判氣孔限制和非氣孔限制的依據，Pn和Ci值同時下降時，Pn的下降為氣孔限制；相反，如果葉片Pn的降低伴隨著Ci值的提高，說明光合作用的限制因素是非氣孔限制。本試驗石油烴和重金屬Cd 單一及其復合污染處理后，艾蒿及紫花苜蓿Pn顯著降低，并伴隨著Ci的升高，這說明石油烴和Cd 污染下2 種植物葉片光合作用的下降不是由于氣孔導度的下降導致CO2供應減少所致，而是光化學活性限制、羧化限制和無機磷限制等非氣孔因素阻礙了CO2的利用，從而造成細胞間CO2積累。

植物凈光合作用速率的下降與葉片總葉綠素含量下降趨勢具有一致性。有研究表明[15]， Cd 脅迫下，植物葉綠體結構受損，葉綠素生物合成所必需的葉綠素酸酯還原酶和氨基-γ-酮戊酸的合成受阻，導致葉綠素總量降低。如前所述，石油烴和重金屬Cd 污染使艾蒿和紫花苜蓿葉綠素含量降低，污染脅迫破壞植物的葉綠素結構，導致葉綠素含量降低，進而抑制植物光合作用，植物長勢弱和生長量減少，這與前述污染脅迫下對植物表觀形態觀察結果相一致。

2.3 植物修復對土壤TPHs 含量和土壤呼吸速率的影響

植物修復后污染土壤中TPHs 如圖5 所示。經過75 d 的植物修復，與對照處理相比較，石油烴單一污染土壤及石油烴與Cd 復合污染土壤的TPHs 與初始濃度相比均顯著降低，且艾蒿和紫花苜蓿修復土壤的石油烴含量都顯著低于無植物修復處理的土壤，說明植物能有效提高石油烴污染土壤修復效率。單一石油烴污染土壤在凍融和恒溫處理條件下，艾蒿和紫花苜蓿對土壤中石油烴的去除效果高于復合污染處理土壤。

圖5 植物修復對污染土壤總石油烴含量的影響Fig. 5 Effect of phytoremediation on total petroleum hydrocarbon content of contaminated soil

微生物在促進土壤中石油烴污染物去除中具有重要作用，微生物活性的強弱在一定程度上反映了微生物去除污染物的效率。土壤呼吸是表征土壤生物學特征和物質代謝強度的重要指標，可以用于反映土壤微生物群落總代謝活性。植物修復對污染土壤總石油烴降解率及土壤呼吸速率的影響如圖6 所示。土壤經75 d 修復后，植物修復處理的土壤呼吸速率較之未種植物的高，說明植物可以增強土壤微生物群落總代謝活性，進而強化對石油烴污染物去除效率。圖5和圖6 還表明，艾蒿和紫花苜蓿在凍融與恒溫處理中對石油烴的去除作用未表現出顯著差異，這說明本試驗僅依靠凍融處理尚不能顯著提高石油烴污染土壤修復效率，還需要在以后研究中進一步配合其他土壤環境調控措施來強化植物修復效率。

圖6 植物修復條件下土壤石油烴降解率與土壤呼吸速率的關系Fig. 6 Relationship between soil petroleum hydrocarbon degradation rate and soil respiration rate under phytoremediation

在植物根際作用下紫花苜蓿修復污染土壤石油烴去除率可達到50.91%～56.61%，較之無植物處理土壤高出26.00%；石油烴污染土壤凍融和恒溫處理條件下，艾蒿的石油烴降解率分別為60.69%、58.11%。艾蒿和紫花苜蓿修復土壤的呼吸速率顯著高于無植物土壤；除復合污染凍融處理外，艾蒿的土壤呼吸速率也顯著高于紫花苜蓿，這可能是由于與紫花苜蓿相比，艾蒿具有更為發達的根系，不僅有利于與污染物接觸與吸收，而且植物根系能夠積極的改變和調節土壤環境以促進微生物的生長和活動，利于活體生物的新陳代謝活動。

2.4 植物修復對污染土壤Cd 含量的影響

艾蒿和紫花苜蓿修復重金屬Cd、石油烴及其復合污染土壤后的土壤中Cd 含量變化見圖7。在75 d 的植物修復后，與土壤初始Cd 濃度相比，種植艾蒿及紫花苜蓿的土壤中Cd 濃度均都有所下降。Cd 單一污染條件下，紫花苜蓿修復土壤的Cd 濃度下降幅度為4.25 mg·kg–1，艾蒿修復土壤處理的Cd 濃度由21.85 mg·kg–1下降到9.80 mg·kg–1，下降幅度達12.05 mg·kg–1，表明艾蒿修復Cd 污染土壤的能力比紫花苜蓿強。復合污染條件下，艾蒿和紫花苜蓿修復土壤中Cd 濃度的下降幅度明顯小于Cd 單一污染處理，這與復合污染脅迫對植物的傷害較大，導致植物對土壤中重金屬的凈化能力降低有關。

圖7 植物修復對污染土壤Cd 含量的影響Fig. 7 Effect of phytoremediation on cadmium content in contaminated soil

試驗結果表明，雖然艾蒿和紫花苜蓿對土壤Cd 污染都具有一定的修復作用，但艾蒿對Cd 的富集作用更強，較之紫花苜蓿更為適于凈化Cd 污染土壤。未種植植物的污染土壤中Cd 濃度在試驗前后基本沒有變化，進一步說明了植物修復是有效去除污染土壤中重金屬的重要途徑。

3 結 語

與單一污染相比較，石油烴與Cd 的復合污染會引起艾蒿和紫花苜蓿葉片相對電導率增大、葉綠素含量和植物凈光合速率降低等現象，說明復合污染對植物的脅迫作用大于單一污染。植物修復可以有效強化石油烴與Cd 復合污染土壤中污染物的去除，艾蒿抗重金屬 Cd 的污染脅迫的能力高于紫花苜蓿，其對于石油烴與Cd 復合污染土壤具有較好的修復潛力。凍融作用在石油烴與重金屬Cd 復合污染土壤的植物修復方面未發揮出明顯的協同作用，需要在后續研究中進一步研發調控措施改善污染土壤的植物生長環境因子。