青花菜Whirly基因的克隆、系統進化及表達特征分析

荊贊革， 裴徐梨， 李成慧， 唐 征， 馮鵬宇

(1.昆明學院農學與生命科學學院，昆明 650214；2.溫州科技職業學院農業與生物技術學院，浙江 溫州 325006)

【研究意義】植物在生長過程中會受到各種非生物脅迫因素的影響[1-2]。在長期的自然選擇中，植物進化出了一套生長調節機制抵御這些不利因素的影響[3-6]。作為主要的非生物脅迫因素之一，漬水脅迫在多雨地區或季節會對植物生長和抗病產生不利影響，甚至會對農業生產造成嚴重損失。因此，研究植物漬水脅迫相關基因及其在植物抗漬水脅迫過程中的分子調控機制，對于植物抗漬水脅迫品種的選育改良有重要意義。青花菜屬十字花科蕓薹屬[7]，不耐澇，淹水數天后其根系就會死掉[8]。浙江沿海一帶是青花菜的主要產區之一，每年栽培期間易受臺風、暴雨等侵襲，給青花菜生產帶來嚴重損失[9]。Whirly轉錄因子在植物抗病信號轉導途徑、維持端粒長度、維護細胞器基因組穩定性等方面都發揮著重要功能[10-12]。因此，克隆青花菜Whirly轉錄因子，對進一步研究其漬水脅迫響應及其生物學功能具有重要意義。【前人研究進展】第1個Whirly家族成員是從馬鈴薯中分離出來的，其以單鏈形式與誘導應答元件ERE結合，通過調控Pr-10a基因來調節抗病信號傳導途徑[13]。后續又在三明野生蕉[14]、杧果[15]、土豆[16]、木薯[17]、辣椒[18]、黃瓜[19]等多種園藝作物中鑒定到該基因家族成員。在植物逆境響應中，Whirly蛋白質可與誘導應答元件結合調節相關基因的表達[19]。Whirly1可調節發育衰老過程中水楊酸的穩態[20-21]。Atwhy1擬南芥突變體對SA誘導的敏感性增加，表明其是該信號途徑中的重要調控因子。沉默水稻OsWhirly基因可增強超敏反應[22]，表明其可能是該反應的負調控因子[23]。Whirly基因同樣在維持植物細胞器穩定中發揮重要作用。玉米中ZmWHY1基因產生的ZmWHY1蛋白能與CRS1蛋白形成結合蛋白，促進葉綠體atp內含子的剪切。Whirly基因還被認為與胚胎發育和種子萌發有關。例如在Emb16玉米胚乳缺陷突變體中發現其胚胎發育停滯，胚乳會繼續發育成大胚乳，其原因是Whirly基因突變[21]。【本研究切入點】雖然在一些有代表性植物如水稻、擬南芥、玉米等深入探討了Whirly基因的部分功能，但大多數植物中Whirly基因的具體功能尚不清楚，特別是在青花菜等甘藍類蔬菜中。目前關于青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的作用機理還不清晰透徹。本試驗克隆得到青花菜Whirly基因，分別命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3，并利用生物信息學方法預測獲得Whirly基因的理化性質參數、二級結構等，分析青花菜Whirly基因的進化關系及在漬水脅迫中不同時期的基因相對表達量。【擬決解的關鍵問題】本研究通過克隆青花菜Whirly基因，并對其序列特征、系統進化以及漬水脅迫下的表達特征等進行分析，為進一步深入研究其漬水脅迫響應及其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以青花菜自交系“KU20-7”為試驗材料，常規育苗。5葉期時進行漬水脅迫處理，處理時間為0、2和6 d，每個處理設3次生物學重復。

1.2 青花菜Whirly基因的克隆

提取葉片總RNA后反轉錄成cDNA。參照本實驗室青花菜轉錄組unigene庫中Whirly基因的序列，設計引物(表1)。RT-PCR反應體系和程序參照裴徐梨等[24]的方法進行。對PCR擴增的特異條帶進行克隆測序。

表1 青花菜Whirly基因克隆的引物序列

1.3 青花菜Whirly基因序列特性分析

利用ExPASy proteomice Sever預測青花菜Whirly蛋白的氨基酸分子量和等電點。利用SOSUI工具預測青花菜Whirly蛋白氨基酸序列的跨膜結構。

1.4 Whirly蛋白系統發育樹的構建

利用軟件MEGA 6.0對青花菜、甘藍、擬南芥、江南卷柏、挪威云杉、無油樟等物種的Whirly氨基酸序列進行多重比對，而后構建系統發育樹。

1.5 青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征分析

以青花菜actin為內參基因，檢測青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征。青花菜Whirly基因的熒光定量引物序列見表2。qRT-PCR反應體系和程序參照裴徐梨等[24]的方法進行。

表2 青花菜Whirly基因qRT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 青花菜Whirly基因的克隆

RT-PCR擴增到3個特異條帶(圖1)，測序結果表明3個特異性條帶均為Whirly基因家族成員，將其命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3。3個基因的長度分別為795、723和783 bp，分別推導編碼264、240和260個氨基酸(圖2)。

M：DL 2000 marker；1～3：目的片段M：DL 2000 marker；1-3：Target fragment圖1 青花菜Whirly 基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Whirly gene in broccoli

下劃線：引物序列Underlines: Primer sequences圖2 青花菜Whirly 基因序列比對Fig.2 Sequence alignment of Whirly gene in broccoli

2.2 青花菜Whirly基因家族成員序列特性分析

BoWHY1理論等電點(pI)為9.18，相對分子質量為28.81 kD，包含1個長度為23 aa的跨膜螺旋(RAEFTVLVSAFNFVLPYLIGWHA)。BoWHY2的理論等電點(pI)為9.48；相對分子質量為26.22 kD，為可溶性蛋白。BoWHY3的理論等電點(pI)為9.58；相對分子質量為28.63 kD，包含1個跨膜螺旋(TKAEFAVLISAFNFILPHLIGWQ)，長度為23 aa。

2.3 Whirly蛋白系統發育樹的構建

系統進化樹結果表明，藻類、苔蘚、裸子等低等植物位于進化樹的底端，被子植物則聚為1個大組。被子植物又可分為2個亞組，第1個亞組包含16個Whirly家族成員，其中烏油樟、葡萄、楊樹和木瓜相對獨立，高等植物(擬南芥、蘿卜、白菜、甘藍和青花菜)則聚在一起。十字花科的Whirly基因成員又可細分為2個大分支，青花菜BoWHY1和BoWHY3則位于不同的小分支中。被子植物第2個亞組包含9個Whirly成員，聚類情況和第一亞組基本相同。青花菜BoWHY2位于本亞組中，表明其與BoWHY1和BoWHY3的親緣關系相對較遠(圖3)。

圖3 青花菜Whirly 基因家族的系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Whirly gene family in broccoli

2.4 青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征分析

熒光定量PCR技術檢測結果顯示，BoWHY1的表達量隨脅迫時間的延長其表達量逐漸下降。BoWHY2在漬水脅迫2 d時表達上升，表達量為對照的3.21倍，在漬水脅迫6 d時下降，表達量約為對照的1/5。BoWHY3在處理2 d時的表達量為1.42，6 d時的表達量為0.26，呈現出先上升后下降趨勢(圖4)。

圖4 青花菜Whirly 基因在漬水脅迫下的表達特征Fig.4 Expression profile of Whirly gene under waterlogging stress in broccoli

3 討 論

本研究從青花菜中克隆獲得3個Whirly基因家族成員，分別命名為BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3。考慮部分近緣物種的基因數量，本研究認為已經基本上獲得了所有的青花菜Whirly基因。其中BoWHY1與BoWHY3推導的氨基酸序列其氨基酸的個數相似，均包含1個長度相等、結構相似的二級結構跨膜螺旋。而BoWHY2推導的氨基酸序列在組成其氨基酸的個數、蛋白質的二級結構和蛋白質等電點等方面與另外兩者之間存在差異。表明從序列特性的角度來看，BoWHY1與BoWHY3的相似度比BoWHY2更高。利用生物信息學的方法，分別從甘藍、白菜、擬南芥、蘿卜等物種中鑒定出4、3、3和3個Whirly基因[25-26]。

系統進化的分析結果顯示，青花菜BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3同被子植物的Whirly成員位于同一大的分支上，其中BoWHY1和BoWHY3位于同一亞組中，而BoWHY2位于另一亞組中，因此筆者推測BoWHY1和BoWHY3屬于旁系同源基因。另外藻類、苔蘚、裸子等低等植物的Whirly在進化樹上自成一個分支并位于進化樹的底端，推測植物Whirly基因可能由一個祖先基因進化而來。這個祖先基因在藻類[27]、苔蘚、蕨類植物中基本上未進行擴張，大多植物僅保留1個拷貝，甚至在個別物種中該基因消失。而到被子植物時該基因則開始擴張，變為2個拷貝，伴隨著物種的進化以及多倍化過程的進行，不同的物種Whirly基因的數量則變得不同[16-18]。相對于其他一些成員較多的基因家族，Whirly基因的進化模式是比較簡單的[28-30]。

高等植物的多倍化使其產生很多的旁系同源基因[31-34]，在進化的過程中，這些旁系同源基因會發生功能上的改變[35]。本試驗通過qRT-PCR檢測了青花菜Whirly基因在漬水脅迫下的表達特征，其表達特征差異明顯，其中BoWHY2的相對表達量在漬水處理2 d達到最大值，是前期的3.21倍。作為旁系同源基因的BoWHY1和BoWHY3，二者在漬水脅迫下的表達特征差異明顯。BoWHY1的表達量隨脅迫時間的延長其表達量逐漸下降，而BoWHY3則呈先上升后下降趨勢，表明其對漬水脅迫的響應機制可能存在較大不同。產生這種現象的原因就在于長期進化的過程中旁系同源基因BoWHY1和BoWHY3可能發生了亞功能化。

4 結 論

本研究克隆了3個青花菜Whirly基因。序列特征分析表明，BoWHY1與BoWHY3的親緣關系相似度比BoWHY2更高。系統進化分析發現藻類、苔蘚和裸子植物Whirly成員位于進化樹的底端，高等植物Whirly成員則聚在一起，且BoWHY1和BoWHY3具有更近的親緣關系。qRT-PCR分析結果顯示，BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3在漬水脅迫下展現出不同的表達模式。