鉆葉紫菀對鎘脅迫的生理響應及富集轉運特征

陳 偉，蔣文艷，楊玉霞，廖 潔，梁雪蓮，王海軍，魏源文，王天順

(廣西農業科學院農產品質量安全與檢測技術研究所/全國名特優新農產品全程質量控制技術南寧中心，南寧 530007)

【研究意義】鎘(Cd)對植物是一種非必需重金屬元素，Cd污染主要來源于工業采礦及農藥、污泥和磷肥施用等人類活動，且Cd對生態環境污染的影響隨著工農業的迅速發展而日益加重[1]，以礦山開采過程洗礦和選礦廢液排放及尾礦中所含的Cd對周圍環境、地表水和地下水造成的污染更嚴重[2]。目前，Cd污染土壤的修復方法主要有物理、化學和生物修復等。植物修復屬于生物修復技術，已開始進入初步商業化階段，是國際學術界研究的熱點之一[3]。近年來，我國報道具有自主知識產權的超積累植物，有Zn超積累植物東南景天、As超積累植物蜈蚣草、Cd超積累植物油菜和寶山堇菜、Cr超積累植物李氏禾及Mn超積累植物商陸和青葙，但品種有限，與我國是一個植物資源十分豐富的大國地位不相稱。廣西農業科學院農產品質量安全與檢測技術研究所環境修復調控課題組前期已篩選出對Cd具有富集和耐性強且生物量較大(株高達160 cm，單株鮮重達1.01 kg)的菊科植物鉆葉紫菀(AstersubulatusMichx.)，但未深入探討其受Cd脅迫的生理指標及對Cd的富集轉運特征。因此，分析Cd脅迫條件下鉆葉紫菀的生理指標變化情況及對Cd的富集轉運特征，對挖掘重金屬富集植物及推動Cd污染環境的植物修復技術應用具有重要意義。【前人研究進展】超富集植物是指能超量吸收重金屬并將其轉移到地上部的植物，其不僅可超量累積植物生長發育所必需的重金屬離子，還可耐受并累積一些非必需重金屬離子，如Cd、Cr和Pb等。由于各種重金屬在地殼中的豐度及在土壤和植物中的背景值存在差異，因此超富集植物的富集濃度界限也有所不同，目前采用較多的是Baker和Brooks[4]提出的參考值，即將地上部Cd含量在100.00 mg/kg以上，Co、Cu、Ni和Pb含量在1000.00 mg/kg以上，以及Mn和Zn含量在10 000.00 mg/kg以上的植物稱為超富集植物。理想的超富集植物還應具有抗逆性強、生物量大(尤其是地上部生物量)及能同時富集2種或多種重金屬的特點。據不完全統計，目前全球共發現720多種重金屬超富集植物，其體內重金屬濃度均達到或超過Baker和Brooks[4]設定的標準，其中，Ni超富集植物約300種、Pb超富集植物17種、Zn超富集植物21種、Cd超富集植物20種、Cu超富集植物38種、Mn超富集植物11種和As超富集植物5種等，而且多分布于歐洲、中亞、非洲和北美洲[5]。近年來研究較多的Cd超富集植物有油菜[6]、商陸[7]、圓錐南芥[8]、葉用紅菾菜[9]和寶山堇菜[10]。部分超富集植物在重金屬污染植物修復方面已得到應用，如涂鵬飛等[11]在Cd輕度污染的土壤進行冬季種植紅葉甜菜與夏季復種花生輪作，結果發現該輪作模式可將土壤Cd含量由0.316 mg/kg降至0.286 mg/kg；陳績等[12]利用黃腐酸鉀和東南景天聯合修復Cd污染土壤，在0～4個月且黃腐酸鉀用量為0.3%時修復效果最明顯，東南景天地上部Cd積累量顯著提高；童文彬等[13]采用有機物料和特異內生菌強化等措施，利用東南景天/油葵輪作修復田間條件下土壤中的Cd，經一輪修復就能從土壤中提取出Cd 394.8 g/hm2。【本研究切入點】目前，關于鉆葉紫菀受Cd脅迫后生理指標變化情況及對Cd富集轉運特征的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】開展梯度濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉部過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和葉綠素含量的影響及鉆葉紫菀根、莖、葉組織對Cd的吸收、轉運和富集能力研究，旨在闡明鉆葉紫菀對Cd的富集耐受能力，以期為Cd污染土壤的植物修復、植物Cd富集和耐受機制研究提供種質資源，為推動利用植物修復Cd污染環境提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣所在的鉛鋅礦區屬亞熱帶季風氣候，四季分明，雨熱同季，光照充足；春季干旱多風，夏季高溫多雨，秋季溫和涼爽，冬季溫和少雨，年均氣溫約23 ℃，年均降水量1780 mm，年無霜期一般長達350 d以上。采樣區土壤pH 6.4～8.3、有機質4.9～33.4 g/kg、全磷0.027%～0.094%、全鉀1.05%～1.34%、全氮0.030%～0.168%、全鎘9.8～24.4 mg/kg、全鉛539.8～1083.5 mg/kg、全鋅548.3～1044.2 mg/kg。供試鉆葉紫菀的種子采自鉛鋅礦區，種子經乙醇消毒后種植在無Cd土壤中進行幼苗培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 采用營養液砂培試驗，待鉆葉紫菀幼苗長出6張完整葉片時，選取生長一致的幼苗，用超純水沖洗根部，移栽于口徑、高和底徑分別為16.0、11.0和9.0 cm的塑料桶，每桶含砂2.5 kg，種植鉆葉紫菀3株，施加營養液1.0 L[14]，10 d后再施營養液1.0 L，期間補充超純水維持鉆葉紫菀生長。培養30 d后，施用不同濃度含Cd營養液，每處理3次重復。試驗設7個濃度Cd(以CdCl2·2.5H2O形態加入)處理，分別為對照(CK，0 mg/L)及T1(2.5 mg/L)、T2(5.0 mg/L)、T3(10.0 mg/L)、T4(15.0 mg/L)、T5(20.0 mg/L)和T6(30.0 mg/L)處理，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調節營養液的pH為5.6左右。各Cd濃度處理首次施用Cd營養液0.5 L，每隔3 d再施用含Cd營養液0.5 L，連續施用5次，之后每隔3 d施用超純水0.5 L，CK同期施用純水0.5 L，24 d后測量各處理鉆葉紫菀的株高并采收植株備用。

1.2.2 樣品采集與處理 將采收的鉆葉紫菀植株除去黏附的細沙，用自來水將根部沖洗干凈，再將根部置于20.0 mmol/L的Na2-EDTA溶液中浸泡20 min以除去表面吸附的Cd2+，以去離子水將植株反復沖洗干凈后再用吸水紙擦拭干凈[15]。

將鉆葉紫菀分為根、莖和葉3個部分，取部分葉片用液氮速凍后超低溫保存，用于測定CAT活性、POD活性和葉綠素含量，其余根、莖和葉于105 ℃殺青30 min后，在70 ℃烘箱中烘干至恒重，計算根、莖和葉的干重(生物量)及葉的含水率，研磨樣品過0.5 mm篩后稱取磨碎的根、莖和葉各0.2000 g至微波消解罐中，加入3.0 mL H2O2和6.0 mL濃HNO3后密封進行微波消解，消解液轉移至容量瓶定容后待測。

1.2.3 測定項目及方法 采用紫外吸收法測定CAT活性[16]，采用愈創木酚法測定POD活性[16]，采用比色法測定葉綠素含量[17]，采用石墨爐原子吸收光譜儀測定鉆葉紫菀根、莖和葉的Cd含量[18]，采用直接測定法測定鉆葉紫菀的株高[18]，采用烘干恒重法測定鉆葉紫菀的生物量[19]。

Cd轉運系數(TF)=莖或葉Cd濃度/根Cd濃度

Cd富集系數(BCF)=根或莖或葉Cd濃度/培養介質Cd濃度

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2010進行整理，以SPSS 18.1進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對鉆葉紫菀株高的影響

如表1所示，所有Cd處理鉆葉紫菀的株高較CK均有所降低，其中，降幅較大的是T1和T2處理，其株高分別較CK顯著降低10.0%和10.6%(P<0.05，下同)，其余處理的株高與CK無顯著差異(P>0.05，下同)；與T1處理相比，T2處理鉆葉紫菀的株高降低0.7%，但差異不顯著，而T3～T6處理鉆葉紫菀的株高分別較T1處理升高2.5%、5.2%、3.3%和7.6%，但差異不顯著。可見，不同濃度Cd脅迫條件下鉆葉紫菀生長均受到不同程度的抑制，但10.0～30.0 mg/L Cd脅迫鉆葉紫菀的株高生長均優于2.5～5.0 mg/L Cd脅迫。

表1 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀株高的影響

2.2 Cd脅迫對鉆葉紫菀生物量(干重)的影響

如表2所示，T1和T3處理鉆葉紫菀的干重分別較CK降低9.8%和9.9%，但差異不顯著；T2、T4、T5和T6處理的干重分別較CK顯著降低19.2%、17.2%、16.8和14.2%；與T1相比，隨著Cd脅迫濃度的增加，鉆葉紫菀的干重呈現下降趨勢，但差異均未達顯著水平，其中T2處理鉆葉紫菀干重的降幅最大，降低10.4%。可見，不同濃度Cd脅迫均能降低鉆葉紫菀的干重，但2.5和10.0 mg/L Cd脅迫對鉆葉紫菀干重的影響相對較小。

表2 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀干重的影響

2.3 Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片CAT活性的影響

從圖1可看出，與CK相比，T1處理鉆葉紫菀葉片的CAT活性僅提高1.38%，差異不顯著；其他處理鉆葉紫菀葉片的CAT活性均顯著提高，其中，T3處理的CAT活性最高，其增幅最大，達47.80%，且顯著高于其他處理，而T4處理的CAT活性增幅最小，僅16.86%；隨著Cd脅迫濃度的提高，鉆葉紫菀葉片CAT活性呈先上升后下降再上升的變化趨勢。可見，不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片CAT活性均具有提升作用，但升幅不同，表明Cd脅迫的鉆葉紫菀葉片CAT可能發生了應激反應，從而在一定程度上緩解Cd對葉片的脅迫作用。

圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)，the same as below圖1 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片CAT活性的影響Fig.1 Effects of different Cd concentration treatments on CAT activity in leaves of A. subulatus Michx.

2.4 Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片POD活性的影響

從圖2可看出，與CK相比，所有Cd脅迫處理鉆葉紫菀葉片的POD活性均顯著提高，其中，T5和T6處理的增幅最大，分別增加72.75%和72.03%，T3處理的增幅最小，僅增加23.95%；隨著Cd脅迫濃度的提高，鉆葉紫菀葉片POD活性呈先上升后下降再上升的變化趨勢。可見，不同濃度Cd脅迫均可顯著提高鉆葉紫菀葉片的POD活性，但提高幅度不同，表明Cd脅迫下鉆葉紫菀葉片POD可能發生了應激反應，從而在一定程度上緩解Cd對葉片的脅迫作用。

圖2 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片POD活性的影響Fig.2 Effects of different Cd concentration treatments on POD activity in leaves of A. subulatus Michx.

2.5 Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片葉綠素含量的影響

從圖3可看出，與CK相比，T1、T2和T3處理鉆葉紫菀葉片的葉綠素含量稍有增加，增幅分別為11.17%、4.86%和15.89%，但差異不顯著；其余處理鉆葉紫菀葉片的葉綠素含量均顯著增加，其中T5處理的增幅最大，增加33.36%。可見，不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片葉綠素含量均有提升作用，但提升幅度不同，表明Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片葉綠素含量增加具有促進作用，這或許是本研究中鉆葉紫菀葉片始終保持綠色未出現肉眼可見毒害現象的原因所在。

圖3 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of different Cd concentration treatments on chlorophyll content in leaves of A. subulatus Michx.

2.6 Cd脅迫對鉆葉紫菀Cd含量的影響

從表3可看出，隨著Cd濃度的增加，與CK相比，鉆葉紫菀根、莖和葉的Cd含量明顯增加，其中，T6處理鉆葉紫菀根、莖和葉的Cd含量均達最大值，分別為1075.13、34.33和179.47 mg/kg；與T1處理相比，除T2處理根和莖的Cd含量外，其余處理根、莖和葉的Cd含量均顯著增加，其中T2處理根、莖和葉的Cd含量較T1處理分別增加78.20%、56.48%和247.41%，T6處理根、莖和葉的Cd含量較T1處理分別增加12.37、3.68和24.17倍。可見，隨著Cd脅迫濃度的增大及培養時間的延長，鉆葉紫菀生長過程中Cd由根部吸收并向地上部轉運，在地上部累積能力逐漸增強。

表3 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀Cd含量的影響

2.7 Cd脅迫對鉆葉紫菀Cd轉運和富集的影響

從圖4可看出，在Cd脅迫下，Cd從鉆葉紫菀根部轉運至莖葉過程中，隨著Cd脅迫濃度的增大，葉Cd的TF呈現先增大后減小再增大的變化趨勢，莖Cd的TF呈逐漸減少趨勢；葉Cd的TF為0.09～0.17，莖Cd的TF為0.03～0.09，其中，T4處理葉Cd的TF最小，比T1處理減小4.32%；T2處理葉Cd的TF升至最大值0.17，是T1處理的1.91倍；莖Cd的TF在T6處理時最小，為0.03，僅為T1處理的35.16%。

圖4 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀Cd TF的影響Fig.4 Effects of different Cd concentration treatments on Cd TF in A. subulatus Michx.

從圖5可看出，在Cd脅迫下鉆葉紫菀根、莖和葉對Cd均有一定的富集作用。隨著Cd脅迫濃度的增大，鉆葉紫菀根Cd的BCF呈先減小后增大再減小的變化趨勢，其中，T3處理根的BCF最小，為25.31，比T1處理減小21.34%，T5處理根Cd的BCF最大，為39.25，比T1處理增大21.99%；莖Cd的BCF呈逐漸減小的變化趨勢，在T6處理時最小，為1.14，僅為T1處理的39.02%；葉Cd的BCF呈先增大后減小再增大的變化趨勢，但T2～T6處理的BCF均大于T1處理，以T6處理葉Cd的BCF最大，為5.98，是T1處理的2.10倍。

圖5 不同濃度Cd脅迫對鉆葉紫菀Cd BCF的影響Fig.5 Effects of different Cd concentration treatments on Cd BCF in A. subulatus Michx.

綜上所述，鉆葉紫菀對Cd有較強的吸收富集能力，且具有一定的轉運能力，可嘗試作為Cd富集或超富集能力植物用于Cd污染土壤或濕地修復。

3 討 論

植物吸收Cd并在各組織間轉運累積會影響其生理生化過程，抑制植物正常生長，從而影響植物株高和生物量[20]。朱潤華等[21]研究表明，隨著培養介質中Cd濃度的增大，苦苣幼苗的株高呈現下降趨勢，與CK相比，在10.0 mg/L Cd處理下苦苣幼苗株高下降22.2%。關萍等[22]研究結果也顯示，在Cd脅迫條件下2種蔊菜的株高均較CK下降。本研究結果與上述研究結果相似，不同濃度外源Cd脅迫鉆葉紫菀的株高均呈降低趨勢，但葉片始終保持綠色未出現肉眼可見的毒害現象，其中，5.0 mg/L處理鉆葉紫菀的株高降幅相對較大，較CK顯著降低10.6%，而10.0～30.0 mg/L處理鉆葉紫菀的株高與CK無顯著差異。

花莉等[23]研究發現，隨著Cd脅迫濃度的增大，龍葵的生物量較CK下降。黃欣等[24]研究認為，高濃度和低濃度Cd脅迫對翅堿蓬的生物量均有一定的抑制作用。鄒淑華等[25]研究證實，在Cd脅迫下東南景天的生物量積累受到抑制。本研究結果與上述研究結果相似，所有Cd濃度脅迫鉆葉紫菀的干重均呈下降趨勢，其中5.0 mg/L Cd脅迫鉆葉紫菀的干重降幅相對較大，較CK降低19.2%。但也有研究表明，低濃度Cd脅迫能促進植物生物量增加，高濃度Cd脅迫會抑制植物生長[26]。

植物遭遇重金屬脅迫時，其體內自由基含量及活性氧隨之提升，此時植物會啟動自身的抗氧化酶系統應對逆境脅迫[27]。唐秀梅等[28]研究發現，龍葵的POD和CAT活性隨著Cd脅迫濃度的增大呈先升高后降低再升高的趨勢。花莉等[23]研究表明，隨著Cd脅迫濃度增大，龍葵葉片的POD和CAT活性均呈先升高后降低再升高的趨勢。本研究也發現類似現象，隨著Cd脅迫濃度增大，鉆葉紫菀葉片的POD和CAT活性均呈先升高后降低再升高的趨勢，這可能是POD和CAT活性均隨著鉆葉紫菀體內活性氧的增多其應激性升高，二者協同作用消除了過氧化物和自由基產生的毒害。但也有不同的研究觀點，如王利芬等[29]研究認為，隨著Cd脅迫濃度的增大，金盞菊葉片中POD和CAT活性呈先升高后降低的趨勢；朱潤華等[21]試驗發現，隨著Cd水培濃度的增大，苦苣幼苗葉片的POD活性呈先降低后升高的趨勢，這可能與不同試驗條件、Cd脅迫濃度和植物不同有關。本研究還發現，在不同濃度Cd脅迫下，鉆葉紫菀葉片的POD和CAT活性均高于CK，表明Cd脅迫并未抑制鉆葉紫菀抗氧化酶的生物合成，酶活性的升高在一定程度上可緩解自由基和活性氧對鉆葉紫菀造成的損傷，使鉆葉紫菀整個代謝系統依然正常運行，這可能是鉆葉紫菀抗氧化系統較一般植物抗逆性強的緣故。

葉綠素在植物光合作用中發揮著極其重要的作用，與光合作用緊密相關[30]。康育鑫等[31]研究發現，萵苣(紫艷)在Cd脅迫下合成較多葉綠素，光合作用效率極大提高，可幫助其緩解Cd脅迫產生的毒害。本研究中，在不同濃度Cd脅迫下鉆葉紫菀葉片的葉綠素含量均呈先升高后降低再升高又降低的變化趨勢，且均高于CK，這可能與本研究中設置的Cd脅迫濃度范圍未對葉綠體的功能造成傷害，從而仍可維持鉆葉紫菀葉片光合作用正常進行有關。

張思宇等[32]研究發現，Cd在黃頂菊植株體內含量表現出根>葉>莖的規律。本研究發現，隨著Cd脅迫濃度的增大，鉆葉紫菀根、莖和葉的Cd含量也逐漸增加，除T1處理莖的Cd含量大于葉的Cd含量外，Cd在鉆葉紫菀組織中積累能力均表現為根>葉>莖。在Cd污染土壤(Cd含量<150.00 mg/kg)種植修復植物馬纓丹，其根、莖和葉的BCF均大于1.00，但TF均小于1.00[33]；在1.0 mg/L Cd處理下培養綠莧菜，其地上和地下部的BCF分別為17.55和33.08，TF為0.53[34]；在10.0 mg/L Cd處理下培養蘆葦，其地上和地下部的BCF分別為94.5和190.7，TF為0.496[35]。本研究結果表明，Cd脅迫下鉆葉紫菀葉的TF為0.09～0.17，莖的TF為0.03～0.09，根的BCF為25.31～39.25，莖的BCF為1.14～2.93，葉的BCF為2.85～5.98，根、莖和葉的BCF均大于1.00。可見，鉆葉紫菀對Cd具有很強的富集能力，但轉運能力一般。

本研究發現，30.0 mg/L Cd脅迫鉆葉紫菀葉的Cd含量達179.47 mg/kg，超過Baker和Brooks[4]設定的Cd超富集植物標準(100.0 mg/kg)，已具備Cd超富集植物特征，且鉆葉紫菀仍可正常生長，葉片CAT活性、POD活性和葉綠素合成均未受到明顯抑制。在Cd脅迫濃度增大到鉆葉紫菀生理耐受極限前，鉆葉紫菀根、莖和葉組織的Cd含量一定還會繼續增加，其莖的Cd含量完全有可能也超過設定的Cd超富集植物標準，因此，后續試驗可通過擴大Cd脅迫濃度范圍，從根、莖和葉組織亞細胞Cd、Cd化學形態及分子機理方面進一步探究鉆葉紫菀的Cd富集能力和機理，明確鉆葉紫菀對Cd的耐受閾值，也可在后續試驗中嘗試利用鉆葉紫菀的Cd富集或超富集能力修復Cd污染土壤或濕地。

4 結 論

在2.5～30.0 mg/L Cd脅迫條件下，鉆葉紫菀的株高、生物量、POD活性、CAT活性和葉綠素含量均受到一定程度影響，但鉆葉紫菀仍可正常生長。鉆葉紫菀根、莖和葉組織對Cd有較強的吸收富集能力，且具有一定的轉運能力，在Cd濃度達到一定程度時表現出Cd超富集植物特征，因此，可嘗試將鉆葉紫菀作為Cd富集或超富集能力植物用于Cd污染土壤或濕地修復。