類葉升麻苷調(diào)控Rnd3/NF-κB通路對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

楊洋 李天發(fā) 王軍 黃珊 凌學(xué)斌

中圖分類號(hào) R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）05-0542-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.06

摘 要 目的 探討類葉升麻苷調(diào)控Rho家族GTP酶3（Rnd3）/核因子κB（NF-κB）通路對(duì)缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響。方法 本實(shí)驗(yàn)將H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組（不給藥、不造模）、H/R組（僅造模）、H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組（以上3組先分別給予10、30、90 μmol/L類葉升麻苷，再造模）、H/R+pcDNA組[先轉(zhuǎn)染pcDNA（空載體），再造模]、H/R+pcDNA-Rnd3組[先轉(zhuǎn)染pcDNA-Rnd3（Rnd3過(guò)表達(dá)載體）使Rnd3過(guò)表達(dá)，再造模]、H/R+AS-H+si-NC組[先轉(zhuǎn)染si-NC（陰性對(duì)照），然后給予90? μmol/L類葉升麻苷，再造模]、H/R+AS-H+si-Rnd3組[先轉(zhuǎn)染si-Rnd3（Rnd3小分子干擾RNA）抑制Rnd3過(guò)表達(dá)，然后給予90 μmol/L類葉升麻苷，再造模]。各組經(jīng)相應(yīng)處理后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平、IL-6水平、Rnd3和NF-κB亞基p65（NF-κB p65） mRNA及蛋白的表達(dá)、活化胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 給予不同濃度類葉升麻苷均可降低H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平、LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高SOD活性和Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平（P<0.05），且呈劑量依賴性。Rnd3過(guò)表達(dá)可使H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡率，NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，使Rnd3蛋白表達(dá)水平和SOD活性升高（P<0.05）;而抑制Rnd3過(guò)表達(dá)，可減弱類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的抑制作用（P<0.05）。結(jié)論 類葉升麻苷可通過(guò)促進(jìn)Rnd3表達(dá)、抑制NF-κB p65表達(dá)來(lái)調(diào)控Rnd3/NF-κB通路，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞 類葉升麻苷;Rnd3/NF-κB通路;缺氧/復(fù)氧;H9c2心肌細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;炎癥反應(yīng)

Effects of acteoside on hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte damage by regulating the Rnd3/NF-κB pathway

YANG Yang，LI Tianfa，WANG Jun，HUANG Shan，LING Xuebin（Dept. of Cardiovascular Medicine， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570102， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To explore the effects of acteoside on hypoxia/reoxygenation （H/R）-induced cardiomyocyte damage by regulating Rho family GTPase 3 （Rnd3）/nuclear factor κB （NF-κB） pathway. METHODS The H9c2 cardiomyocyte were divided into control group （no administration， no modeling）， H/R group （only modeling）， H/R+AS-L group， H/R+AS-M group， H/R+AS-H group （10， 30， 90 μmol/L acteoside for above 3 groups firstly， and then modeling）， H/R+pcDNA group [transfecting pcDNA （empty vector） firstly， and then modeling]， H/R+pcDNA-Rnd3 group [overexpression of Rnd3 by transfecting pcDNA-Rnd3 （Rnd3 overexpression vector） firstly， and then modeling]， H/R+AS-H+si-NC group [transfecting si-NC （negative control） firstly， and then giving 90 μmol/L acteoside and modeling]， H/R+AS-H+si-Rnd3 group [inhibiting overexpression of Rnd3 by transfecting si-Rnd3 （Rnd3 small interfering RNA） firstly， and then giving 90 μmol/L acteoside and modeling]. After corresponding treatment， the apoptotic rate， release of lactate dehydrogenase （LDH） ， malondialdehyde （MDA） level， the activity of superoxide dismutase （SOD）， the level of tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin 1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， mRNA and protein expression of Rnd3 and NF-κB subunit p65 （NF-κB p65）， the expression of aspartate proteolytic enzyme 3 （Cleaved Caspase-3） protein and Cleaved Caspase-9 protein were detected. RESULTS Different concentrations of acteoside could reduce the apoptotic rate of H/R-induced H9c2 cardiomyocyte， the protein expressions of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9， mRNA and protein expressions of NF-κB p65， the levels of LDH release and MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6， while increase the activity of SOD and mRNA and protein expressions of Rnd3 （P<0.05）， in a dose-dependent manner. Overexpression of Rnd3 could decrease the apoptotic rate of H9c2 cardiomyocyte， protein expressions of NF-κB p65， Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9， the levels of LDH release， MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6， while increase the protein expression of Rnd3 and the activity of SOD （P<0.05）. The inhibition overexpression of Rnd3 could weaken the inhibitory effects of acteoside on H/R-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocyte， oxidative stress and inflammatory reaction （P<0.05）. CONCLUSIONS Acteoside could regulate Rnd3/NF-κB pathway by promoting the expression of Rnd3 and inhibiting the expression of NF-κB p65， inhibit cardiomyocyte apoptosis， oxidative stress and inflammation reaction so as to relieve the H/R-induced cardiomyocyte damage.

KEYWORDS? ?acteoside; Rnd3/NF-κB pathway; hypoxia/reoxygenation; H9c2 cardiomyocyte; cell apoptosis; oxidative stress; inflammatory reaction

急性心肌梗死是一種臨床常見(jiàn)的心臟疾病，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流是其主要治療措施，但當(dāng)心肌組織恢復(fù)血流時(shí)，心肌組織損傷可能會(huì)加重從而引起心肌缺血再灌注損傷[1]。缺氧可引起心肌細(xì)胞凋亡從而加重心肌組織損傷[2]。研究表明，中藥及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，并可用于減輕心肌缺血再灌注損傷[3-4]。類葉升麻苷（acteoside）是肉蓯蓉的主要活性成分，基礎(chǔ)研究表明其對(duì)小鼠具有神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶等作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族GTP酶3（Rho family GTPase 3，Rnd3）在肝臟缺血再灌注損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的活化從而減輕肝臟缺血再灌注損傷[6]。本研究采用缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞建立心肌缺血再灌注損傷模型，探討類葉升麻苷是否通過(guò)調(diào)控Rnd3/NF-κB通路進(jìn)而影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過(guò)程。

1 材料

1.1 主要儀器

StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter有限公司;DYCP-44N型快速凝膠電泳槽購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

類葉升麻苷（純度≥98%，貨號(hào)SA8050）、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒（批號(hào)20190115）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)20190203）、胎牛血清（批號(hào)20190205）、Trizol試劑（批號(hào)20190216）、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑（批號(hào)20190101）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑（批號(hào)20181203）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司; Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)20181223）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen有限公司;空載體pcDNA、Rnd3過(guò)表達(dá)載體pcDNA-Rnd3、Rnd3小分子干擾RNA（si-Rnd3）及其陰性對(duì)照（si-NC）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malon- dialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為20181220、20190103、20181116）購(gòu)自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為20181118、20181005、20181018）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;兔抗鼠Rnd3抗體（批號(hào)20190103）、NF-κB亞基p65（NF-κB p65）抗體（批號(hào)20190105）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)20181215）、結(jié)合緩沖液（批號(hào)20181224）、RIPA裂解液（批號(hào)20181118）、聚偏二氟乙烯膜（批號(hào)20181123）、TBST（批號(hào)20181018）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠活化胱天蛋白酶3抗體（Cleaved Caspase-3，批號(hào)20190107）、Cleaved Caspase-9抗體（批號(hào)20190111）、內(nèi)參GAPDH抗體（批號(hào)20190110）與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)20190114）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞

本研究所用大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

本實(shí)驗(yàn)將H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R組、H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-Rnd3組、H/R+AS-H+si-NC組、H/R+AS-H+si-Rnd3組。（1）對(duì)照組：將H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔板（1×104個(gè)/孔），于37 ℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，不進(jìn)行造模;H/R組：參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行H/R造模，將H9c2心肌細(xì)胞接種于6孔板（1×104個(gè)/孔），置于缺氧環(huán)境（37 ℃、5%CO2、<6%O2的培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)24 h，然后將其置于37 ℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧培養(yǎng)6 h;H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組：另取H9c2心肌細(xì)胞分別給予低、中、高濃度（10、30、90 μmol/L）的類葉升麻苷處理[8]，然后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。（2）H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-Rnd3組：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pcDNA（空載體）、pcDNA-Rnd3（使Rnd3過(guò)表達(dá)）轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。（3）H/R+AS-H+si-NC組、H/R+AS-H+si-Rnd3組：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將si-NC（陰性對(duì)照）、si-Rnd3（抑制Rnd3過(guò)表達(dá)）轉(zhuǎn)染至H9c2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后給予90 μmol/L的類葉升麻苷處理[8]，然后參照“H/R組”進(jìn)行H/R處理。每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。

2.2 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清液后加入500 μL結(jié)合緩沖液，然后分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC試劑與5 μL PI試劑，充分混勻后室溫避光孵育10 min，于1 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.3 LDH釋放量、MDA水平、SOD活性檢測(cè)

采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測(cè)LDH釋放量;另將RIPA裂解液加入各組H9c2心肌細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞裂解，檢測(cè)MDA水平和SOD活性。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)。收集各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6水平。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.5 Rnd3、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。取各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入1 mL Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，MgSO4 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因條帶的比值表示Rnd3、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2.6 Rnd3、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。取各組造模、給藥后的H9c2心肌細(xì)胞，加入500 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白后，加入5×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液于沸水中煮10 min使蛋白變性。取變性蛋白，按照每孔40 μg的密度進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜后室溫封閉2 h，加入Rnd3、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗稀釋液與內(nèi)參GAPDH抗體稀釋液（稀釋度分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 800、1 ∶ 800、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育24 h;TBST洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000）后室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值表示蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），表明成功建立心肌缺血再灌注損傷模型;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低更顯著（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

a：與對(duì)照組比較，P<0.05;b：與H/R組比較，P<0.05;c：與H/R+AS-L組比較，P<0.05;d：與H/R+AS-M組比較，P<0.05

3.2 類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，SOD活性顯著降低（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，SOD活性顯著升高（P<0.05）;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平及SOD活性的上述變化程度更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞的LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平及SOD活性的上述變化程度更顯著（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.3 類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞 中Rnd3、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與H/R組比較，H/R+AS-L組、H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與H/R+AS-L組比較，H/R+AS-M組、H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平的上述變化程度更顯著（P<0.05）;與H/R+AS-M組比較，H/R+AS-H組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平的上述變化程度更顯著（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表4。

3.4 Rnd3過(guò)表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA-Rnd3使Rnd3過(guò)表達(dá)后，與H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-Rnd3組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3蛋白表達(dá)水平、SOD活性顯著升高，而細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3、表5。

3.5 抑制Rnd3過(guò)表達(dá)聯(lián)合類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響

轉(zhuǎn)染si-Rnd3抑制Rnd3過(guò)表達(dá)后再給予90 μmol/L的類葉升麻苷，與H/R+AS-H+si-NC組比較，H/R+AS-H+si-Rnd3組H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3蛋白表達(dá)水平、SOD活性顯著降低，而細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，LDH釋放量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表6。

4 討論

研究表明，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及過(guò)度凋亡等均與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)，但其病因及致病機(jī)制尚未完全闡明[9]。臨床常采用藥物、介入與外科手術(shù)等進(jìn)行治療，可改善心肌缺血癥狀，但不能從根本上治愈心肌缺血再灌注損傷;而中藥的副作用較小、治療效果較好，可減輕心肌缺血再灌注損傷，但其作用機(jī)制尚未闡明[10-11]。

類葉升麻苷可通過(guò)增強(qiáng)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性從而減輕缺糖缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制炎癥反應(yīng)從而改善腦缺血再灌注損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12-14]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)后H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高，與既往研究結(jié)果相似[15]，提示成功建立心肌缺血再灌注損傷模型;給予類葉升麻苷可減少H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性，提示類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，類葉升麻苷能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中LDH釋放量、MDA水平升高，SOD活性降低，與既往研究結(jié)果相似[16]，提示類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕細(xì)胞氧化損傷;同時(shí)，類葉升麻苷能逆轉(zhuǎn)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，與既往研究結(jié)果相似[17]，且呈劑量依賴性，提示類葉升麻苷可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥損傷。

Rnd3屬于Rho蛋白家族成員，是Rho蛋白激酶1的抑制物，其在細(xì)胞凋亡、肌動(dòng)蛋白骨架形成等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。研究表明，Rnd3表達(dá)上調(diào)可通過(guò)抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，減輕心肌缺血再灌注損傷;Rnd3表達(dá)下調(diào)可通過(guò)激活NF-κB通路從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。NF-κB通路過(guò)度活化可造成心肌細(xì)胞損傷，抑制其激活可減輕心肌細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞中Rnd3 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，而類葉升麻苷處理后細(xì)胞中上述指標(biāo)水平逆轉(zhuǎn)，提示類葉升麻苷可能通過(guò)調(diào)控Rnd3/NF-κB通路從而減輕心肌缺血再灌注損傷。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，Rnd3過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制NF-κB通路的活化從而抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，而抑制Rnd3過(guò)表達(dá)可激活NF-κB通路從而減弱類葉升麻苷對(duì)H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的抑制作用，提示Rnd3/NF-κB通路可能是類葉升麻苷治療心肌缺血再灌注損傷的潛在通路。

綜上所述，類葉升麻苷可抑制H/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)Rnd3表達(dá)、抑制NF-κB p65表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-08-30 修回日期：2021-12-14）

（編輯：舒安琴）

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