魚用疫苗免疫途徑的研究概況(上)

藺玉珍，王偉偉，黃孔陽，盧 武

(嵊州市甘霖鎮人民政府，浙江 紹興 312462；嵊州市畜牧業發展中心，浙江 紹興 312400)

水產養殖業作為水產品的重要來源，逐漸受到重視。水產養殖業向規模化和品種多樣化方向發展的同時，我國的主要養殖水產品的成活率仍然很低，各種治療藥物不斷涌現，但治療病毒性疾病的藥物卻很少。抗生素和化學藥物的濫用已導致病原菌的嚴重耐藥，并對生態環境造成巨大壓力，最重要的是，化學藥物在魚類體內沉積，危及消費者的健康。因此，疫苗研制則是解決魚類疾病問題的有效方式。

Duf f(1942)首次應用滅活的殺鮭產氣單胞菌口服免疫硬頭鱒獲得成功。其發現不僅提高了魚的保護率，同時抗體水平也得到提高，開創了魚類免疫的先河。1986年我國第一個人工魚用疫苗(草魚出血病細胞培養滅活疫苗)的誕生，為我國翻開了魚用疫苗的新篇章。

隨著疫苗產業的不斷發展，魚類免疫逐漸產生了注射、浸泡和口服3種途徑。本文分別從免疫機理和提高免疫效果等方面對3種免疫途徑進行綜述，同時對水產疫苗的研究前景進行展望。

一、注射免疫

注射免疫是利用少量已知數量的抗原，使其均勻地分布在魚體中，能夠獲得較好的免疫效果，同時相對口服與浸泡兩種免疫方法能夠提高和延長免疫應答反應(Mitchel l H，1995)。它是早期魚類疫苗給藥途徑中最有效和直接的，但該給藥途徑也存在一定的短板，如魚體損傷大、操作難度大、設備要求高且需較多的勞動力，對較小的魚體注射也很不方便(Evel ym T P等，1980；Amend D F等，1981；Aguis C等，1983)。

一般情況下，注射免疫是針對體重大于20克的魚而言，注射所使用的疫苗有多種，有混合疫苗、單價疫苗和多價疫苗等(Busch R A，1997)。隨著接種設備的不斷更新，注射器由以往的簡單手動注射，變成高效自動注射，注射效率極大提升。手動注射則需要在注射前對魚體進行麻醉，一般情況下，1個人在1小時內可注射1 000～1 200尾魚(El l is A，2002)，而機器自動化注射則在1小時之內可達到7 000～9 000尾魚，此方法對魚體的規格要求更高。相對人工注射而言，機器注射具有減小魚體應激反應，減低人工勞動強度的同時縮短注射過程，減少魚體控制時間等優勢，克服了注射免疫方法本身存在的一些劣勢。與傳統的腹腔注射方法相比，最新開發的針對IHN病毒和VHS病毒的DNA疫苗的肌肉注射是一種有效的方法(Cor beil S等，2000)。

1.注射免疫的機理

魚類的免疫系統較為簡單，無哺乳動物的骨髓和淋巴結，主要有胸腺、脾和頭腎，其中頭腎是最主要的免疫淋巴器官(Pr ess C M，1998)，其淋巴組織中包含有淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、血小板、肥大細胞以及非特異性細胞毒細胞(El l is A E，1977；Mil l er N W等，1985)。此外，Rowl ey等(1988)和Mil l er(1998)均證明淋巴細胞又分為類似于哺乳動物的B細胞和T細胞亞群。目前，普遍認為注射免疫主要誘導機體產生系統免疫應答。系統免疫應答又分為非特異性免疫與特異性免疫反應，其中非特異性免疫作為魚體廣譜抵抗水體環境中的不良因素的方式，而特異性免疫應答作為注射疫苗免疫的基礎，對抗原要求具有特異性。其原理為：當魚類免疫系統受到特定抗原刺激時，相對應的免疫細胞對抗原進行識別和呈遞，喚起相對應抗體的活化、增殖以及分化等反應，最終形成大量的抗體，從而產生特異性的免疫應答反應(Mor r ison R N等，2002；Gr abowski L D等，2004；Sant os Y等，2005)。其具有特異性、多樣性、免疫記憶和自身調節的特點。而非特異性免疫則具有非特異性、反應強度弱及不具有免疫記憶等特點(Dalmo R A等，1997)。兩者相輔相成，共同完成系統免疫應答反應。例如，巨噬細胞既可以起到非特異性免疫的吞噬功能，同時也可以對抗原進行吞噬、加工、處理及呈遞(Yano T，1996；安慶云，1998)。Ver varcke等(2005)研究發現利用疫苗注射的方式免疫魚體，其各部位產生免疫應答的強弱是不同的，鰓、皮膚及腸黏膜組織中免疫應答較弱，甚至檢測不到，而其他部位則產生較強的免疫反應。

介導魚類免疫系統的體液因子主要包括抗體的特異性免疫因子和補體、細胞溶素、干擾素、凝集素等非特異性免疫因子(MagnadOt t ir B等，2005)。其中，血液抗體蛋白是魚類免疫系統的主要功能因子。魚類血清中存在的免疫球蛋白引起廣泛的關注，傳統的觀點認為硬骨魚類的血液中只存在類似于哺乳動物的免疫球蛋白IgM(Jur d R D，1985)。但近年來的研究結果證實，存在有四類Ig，分 別 是IgM(Pil st r om L，1996)、IgD(Saha N R等，2004)、IgZ/T(Danil ova N等，2005；Hansen J D等，2005)以及IgM-IgZ(Savan R等，2005)。目前，學者們對魚類免疫系統有一定的研究，基本搞清楚補體、細胞溶素、干擾素、凝集素等魚類非特異性免疫因子生物學活性和免疫學作用(Dal mo R A，1997)，但是一些具體免疫內部機理仍需要進一步的探索。

大量研究表明，魚類腸組織中類似于哺乳動物M細胞的吞噬細胞主要分布在后腸中(Rombout J WH M等，1986；St r and H K等，1997)，主要作用是使魚體對有害抗原進行捕獲、識別和加工。當疫苗注射魚體后，顆粒狀或大分子抗原在魚體腸道內由腸上皮層包裹處理后傳遞到固有層，通過巨噬細胞的識別、加工和呈遞，最后達到免疫的效果(Joost en P H M等，1997；Bosi G等，2005)。

2.提高注射免疫的措施

佐劑是一種非特異性的免疫增強劑，在改善注射免疫效果的過程中其本身沒有免疫原性，只是作為一種增強機體產生應答反應的補充成分，當佐劑和抗原同時注入魚體內或者提前注入魚體內時，能夠有效提升魚體對抗原因子的免疫反應強度，甚至有時能改變免疫應答類型。現如今魚用疫苗聯用的佐劑有兩種類型，分別為礦物質乳膠為基礎的佐劑和油狀物質為基礎的佐劑。其中現有的以礦物質乳膠為基礎的佐劑較為常見且廣泛應用在日常生產中，包括皂土、硫酸鋁以及氫氧化鋁乳膠等；以油狀物質為基礎的佐劑常見的有弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等(War d P D等，1985；Hor ne MT等，1984)。

佐劑的使用可以提高魚類免疫保護效果，主要是由于佐劑能夠增加抗原表面積，延長抗原在體內釋放的時間，與淋巴細胞的接觸更加充分，極大提升漿細胞以及巨噬細胞兩者的活性(Bor ek F，1977；Wal ker P D等，1981)，促進機體對細胞介導的敏感性(Dunier M，1984)，使循環抗體水平得到顯著提升(Maisse G等，1976；St ephen G N等，1985)。另據報道，佐劑與疫苗聯用能產生協同效應，尤其與滅活疫苗聯用效果更加明顯(劉振興等，2007)。Pat erson等(1974)利用殺鮭氣單胞菌對銀大麻哈魚進行注射，同時輔以不同佐劑(氫氧化鋁佐劑和油乳佐劑)，結果表明兩者均能提升免疫效果，且無顯著性差異。

佐劑使用也并不是無弊端，在個別免疫過程中對魚體產生較大的影響。Midt l yng等(1996)研究發現魚體聯用疫苗后，部分魚體注射部位發生潰瘍，對魚體產生較大的傷害。此外，Mut ol oki等(2004)也報道魚體聯用疫苗免疫后，造成不同程度的粘連現象，主要表現在器官之間、器官與腹腔壁之間。Aguis等(1983)認為佐劑無效果，El l is等(1981)和War d等(1985)發現佐劑會降低魚的生長速度，甚至得出較大的危害性結果。

二、口服免疫

目前，口服疫苗的使用方法分為兩種：涂在飼料表面和直接混入飼料，疫苗通過進入魚體內達到免疫保護的效果。其優勢較為明顯，不僅使用方便，對魚體影響小，而且不受魚體大小、時間、地點等影響，降低了勞動強度。另據相關報道，口服免疫能有效提升魚體免疫力，癤瘡病疫苗、弧菌病疫苗、類結節癥疫苗等能得到預期效果，達到免疫水平。然而口服免疫產生的問題還不容忽視，主要表現在免疫效果不夠好，尤其是與浸泡免疫相比，會產生攝食量大的魚浪費疫苗，攝食量不足的魚無法得到足量的疫苗(Quentel C等，1997)。Johnson等(1981)用滅活的弧菌疫苗通過肛門插入法免疫紅大麻哈魚，獲得了良好免疫效果。該發現為口服疫苗提供了不同的接種路徑。為了讓其在后腸發揮充分效果，專家們采取各種技術和方法，來減少消化酶和胃酸對疫苗的破壞，提升其作用時間，充分引起魚體的免疫應答，達到更好的保護效果。

1.口服免疫的機理

魚類雖然是低等脊椎動物，但它仍具有較為完善的免疫系統，在魚的腸道中，尤其是后腸中分布著大量的淋巴細胞(Dal mo R A等，1997)。Quent el等(1997)研究表明，在魚的整個腸道中都存在淋巴細胞，主要包括巨噬細胞、粒細胞和漿細胞3種細胞，而且真骨魚類的頭、腎、脾、胸腺、消化道的淋巴組織、血液和淋巴是產生免疫應答的主要器官與組織(Neal e N T，1971；Ell is A E，1977；Rij ker s G T等，1980)。Abel l i等(1997)通過單克隆抗體技術，應用胸腺細胞在舌齒鱸的腸道中檢測到了淋巴細胞的存在。但是抗原具體是在魚體消化道的哪個部位被吸收，則眾說紛紜。Companj en(2005)證實，魚類抗原的攝入與加工的功能區主要在后腸，進入后腸的抗原被巨噬細胞攝取，誘導魚體產生免疫應答反應。同時Gr ove等(2006)也表明了大西洋比目魚的后腸、鰓等組織含有IgM細胞。而且，也有研究表明，越靠近肛門的地方，其淋巴細胞的數量越多(Abel l i L等，1997)。Daml o等(1997)卻提出了相反的觀點，認為抗原是在前腸被吸收的。盡管如此，目前普遍認為后腸是魚類攝取抗原的主要部位(Pr ess C M等，1999)。

魚類的腸道黏膜層可分為上皮層和固有層兩層(Pr ess C M等，1999；Four nier-bet z V等，2000)。而且粒細胞、巨噬細胞等白細胞主要存在于腸道黏膜層的固有層中(Mc Mil l an D N等，1997)。Rombout等(1993)通過免疫組化檢測發現，在魚的后腸上皮層中存在大量的Ig-細胞，而在固有層中，則主要分布的是Ig+細胞。同時，也有研究表明，在大菱鲆的腸上皮中主要分布的是Ig-細胞，而固有層卻主要含有大量的Ig+細胞(Four nier-bet z V等，2000)，也有報道稱在中腸的上皮層分布有Ig+細胞(Scapigl iat i G等，1996)。為了研究魚類是否存在T、B淋巴細胞，Sizemor e等(1984)從外周血細胞中分離出能與LPS作用的SmIg+細胞，當有輔佐細胞存在時，則SmIg-可與ConA作用。也有研究者用Per ol l不連續梯度的方法對褐鱒外周血淋巴細胞進行分離發現，分布于低密度、表面光滑并且對PHA刺激敏感的淋巴細胞可能相當于人類的T細胞，而相反，分布于高密度、大多表面被毛的淋巴細胞可能相當于人類的B細胞。隨著各種分子生物學技術的發展，Secombes等(1983)、Xia等(1993)、Par t ul a等(1999)、Scapigl iat i等(2000)研究均表明魚類存在相當于哺乳動物的T、B細胞的兩類淋巴細胞。T細胞分布在腸黏膜的上皮層中，而B細胞則分布在腸黏膜的固有層中來參與黏膜免疫應答反應。

魚類黏膜免疫反應是否能夠獨立地完成局部特異性的免疫應答，針對這一問題，有著不同的說法。Quent el(1997)認為魚類口服免疫既能產生局部的黏膜免疫，同時也可引起全身的免疫反應。黏膜免疫在魚類的疾病防御中起著舉足輕重的作用。羅曉春等(2005)對斜帶石斑魚黏膜組織結構(皮膚、鰓、眼角膜、前腸及后腸)進行研究表明，杯狀細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞等免疫相關細胞存在于黏膜組織中，具有黏膜免疫獨立應答基礎。Pr ess等(1999)均認為在真骨魚類腸道黏膜淋巴組織中有不同種免疫細胞，保障魚體各個部分能獨立完成免疫反應。Maki等(2003)也發現斑點叉尾鮰血清和黏液分泌物中抗體的產生是不同步的。雖然口服免疫既能引起黏膜免疫反應，也能引起系統免疫反應。但是，一般認為口服免疫以黏膜免疫為主。

雖在魚類的免疫學方面做了大量的工作，但是目前，魚類口服免疫轉運機制卻不是十分清楚。一些研究表明蛋白或者抗原由后腸上皮細胞以吞噬的方式吸收。Str and等(1997)也認為后腸上皮細胞以內吞方式攝取大分子抗原，小分子可溶性抗原物質可經腸黏膜細胞間隙滲入血液中，而大分子顆粒抗原則先由巨噬細胞吞噬到細胞中經過加工以后，轉運到相關的淋巴組織或細胞中，然后運輸到循環系統，最后經血液或淋巴液轉運至淋巴結產生相關的免疫應答反應(Schep L J等，1999)。另據相關研究，許多真骨魚類后腸的巨噬細胞也有胞飲作用。

(待 續)