制備熒光量子點(diǎn)應(yīng)用于石菖蒲揮發(fā)油中細(xì)辛醚的含量測(cè)定*

益西拉姆 羅珍 達(dá)瓦 靳貴林 馮明科

（西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000）

石菖蒲為一味開(kāi)竅醒神的良藥，其藥理的主要有效成分主要是揮發(fā)油提取物，其中含有揮發(fā)性成分α-細(xì)辛醚(α-asarone)、β-細(xì)辛醚(β-asarone)、甲基丁香酚(methy lequens)等物質(zhì)［1-3］。研究表明石菖蒲揮發(fā)油對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮、抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，藥理機(jī)制上保護(hù)神經(jīng)元、提高血腦屏障通透性的機(jī)理。石菖蒲揮發(fā)油除有較好的益智、腦保護(hù)作用外，對(duì)心血管系統(tǒng)有明顯的保護(hù)作用，且還有平喘、增強(qiáng)腸管蠕動(dòng)、抑制嗎啡戒斷癥狀等作用［4-6］。

本研究旨在通過(guò)建立一種熒光探針進(jìn)行特異性分析與檢測(cè)的分析模型，對(duì)石菖蒲的中的細(xì)辛醚進(jìn)行分析鑒定與含量檢測(cè)。日漸成熟的熒光分析法由于操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，在推動(dòng)民族醫(yī)藥的研究中越發(fā)重要。通過(guò)建立一種熒光探針?lè)治鰴z測(cè)的方法，可以克服天然藥物成分復(fù)雜、難以分析鑒定的特點(diǎn)，能夠快速對(duì)其成分進(jìn)行分析與含量測(cè)定，對(duì)于進(jìn)一步研究該藥物的藥理作用提供了前提基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 所用試劑及儀器

試劑：石菖蒲產(chǎn)地四川，自然陰干后粉碎（過(guò)40目篩），β-細(xì)辛醚對(duì)照品（純度70%），美國(guó)Sigma-Al‐drich 公司，CO2為食品級(jí)［w（CO299.9%）］，其它試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：1L 超臨界萃取裝置，來(lái)自中國(guó)廣州輕工研究所。所有的熒光光譜分析都是通過(guò)日立F-7000熒光分光光度計(jì)（日本東京）進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)和發(fā)射狹縫為5/5 nm，檢測(cè)池為1cm×1cm。紫外/可見(jiàn)吸收光譜由紫外-2450 分光光度計(jì)測(cè)定（日本東京），pHS-3C 數(shù)字pH 計(jì)用于測(cè)定溶液的pH 值（中國(guó)上海），絕對(duì)PL 量子產(chǎn)率光譜儀C11347（日本Hama‐matsu）用于測(cè)定量子產(chǎn)率，碳量子點(diǎn)的粉末通過(guò)Pi‐loFD8-4.3V（美國(guó)Charlotte）中進(jìn)行凍干后獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

提取方法。超臨界CO2萃取法（SCE）:石菖蒲粉料200.00g,超臨界CO2流速2.5L/h,提取壓力6.0MPa，提取溫度45℃，恒溫恒壓萃取2h，出料得淺黃色透明液體，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算揮發(fā)油平均得率。

碳量子點(diǎn)的合成。0.5 g 尿素和1.0 g 二甲雙胍溶解在6 mL 的水中，將混合溶液依次轉(zhuǎn)移到25mL 內(nèi)襯聚四氟乙烯的不銹鋼高壓釜，隨后在180℃下反應(yīng)6h。冷卻至室溫后將粗產(chǎn)物溶解于10mL超純水中。將之前的溶液以3000 rpm離心3 min，將上清液用0.22 mm濾膜過(guò)濾以此除去較大的產(chǎn)物。再通過(guò)100 MWCO的透析膜透析12 h，最后通過(guò)凍干得到灰色的CDs粉末［7-12］。

樣品檢測(cè)。隨后將兩個(gè)平行的200 μL 的CDs（1 mg/mL）和800 μL 的DMF 依次加入1.5 mL 的樣品管中。將200 μL 的待測(cè)品（10-4M）加入到之前的溶液中并進(jìn)行充分渦旋混合，然后將上述混合物分別孵育5min后進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果分析

2.1 表征與線(xiàn)性

首先對(duì)所制備的熒光碳量子點(diǎn)進(jìn)行熒光光譜表征，從熒光光譜來(lái)看，所制備的碳量子點(diǎn)激發(fā)首先對(duì)所制備的CDs 進(jìn)行表征，CDs 在400nm 激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出最大發(fā)射波長(zhǎng)455 nm 的藍(lán)色熒光（圖1A），此外可以觀(guān)察到CDs 在365 nm 的紫外下發(fā)出藍(lán)色熒光（圖1A a,b）。此外通過(guò)HR-TEM 圖像顯示所制備的CDs 類(lèi)似于球形，通過(guò)DLS 可以測(cè)得直徑主要位于4～9 nm范圍內(nèi)，闡述了所合成的CDs 是均勻的且具備良好分散性（圖1B）。通過(guò)加入不同的細(xì)辛醚后掃描得到不同的熒光曲線(xiàn)（圖1C），可以看到響應(yīng)范圍從4×10-7M到6×10-4M 濃度下具有良好的線(xiàn)性范圍(圖1D)。通過(guò)擬合可以得到濃度與熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性曲線(xiàn)，基于此建立了采用熒光碳量子點(diǎn)分析細(xì)辛醚的方法［13-15］。

2.2 樣品分析

將通過(guò)超臨界CO2萃取得到的揮發(fā)油樣品進(jìn)行處理［16］，首先提取物通過(guò)DMF 溶解，經(jīng)過(guò)0.22 μm 的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，然后將溶液稀釋成不同濃度的樣品，稀釋至原溶液的10-6倍，加入將200 μL 的各種濃度的樣品加入到之前的溶液中并進(jìn)行充分渦旋混合，然后將上述混合物分別孵育5min后進(jìn)行熒光測(cè)定，將得到的結(jié)果與建立的回歸曲線(xiàn)進(jìn)行擬合［17-20］，得到細(xì)辛醚含量結(jié)果如表1。

表1 細(xì)辛醚含量占比

從表1 的結(jié)果來(lái)看，通過(guò)超臨界萃取200g 的石菖蒲粉體大約能得到揮發(fā)油的量為2.2g，揮發(fā)油含量約為總體質(zhì)量的1%.與先前的文獻(xiàn)相比，超臨界萃取方法的提取率明顯高于蒸餾法以及微波法。通過(guò)熒光分析法計(jì)算出揮發(fā)油中細(xì)辛醚的含量為2.24 g 左右，占揮發(fā)油總量的70.89%.通過(guò)該方法對(duì)三次超臨界提取后揮發(fā)中的細(xì)辛醚進(jìn)行分析，結(jié)果均具備良好的重現(xiàn)性，結(jié)果闡明了基于熒光量子點(diǎn)應(yīng)用于石菖蒲中揮發(fā)油的檢測(cè)的方法被成功建立。

3 結(jié)論

本研究基于所制備的熒光碳量子點(diǎn)對(duì)于細(xì)辛醚的特異性響應(yīng)，建立了不同濃度的細(xì)辛醚與熒光碳量子點(diǎn)的線(xiàn)性曲線(xiàn)，進(jìn)而得到了細(xì)辛醚濃度對(duì)熒光強(qiáng)度之間的回歸方程。通過(guò)超臨界萃取法從石菖蒲中提取出揮發(fā)油，利用所擬合的回歸方程計(jì)算出揮發(fā)油中細(xì)辛醚的含量，結(jié)果表明石菖蒲揮發(fā)油中細(xì)辛醚含量占比為70%左右。分析結(jié)果體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)中使用的該產(chǎn)地石菖蒲品質(zhì)較好。