CLCF1在腎移植功能恢復延遲中的表達變化

仇煒 王思旭 胡新一 田野 蘇明

移植腎功能恢復延遲(delayed graft function,DGF)是腎移植術后常見的并發癥，其危害較大，并導致患者住院時間延長以及醫療費用的增加，更為嚴重的是DGF可顯著縮短移植腎的存活期，嚴重降低腎移植效果。DGF發病原因目前尚不明確，可能與缺血/再灌注損傷有關[1,2]。因此，發現新的DGF相關因子對于DGF的診斷和治療有重要意義。心肌營養素樣細胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1，CLCF1)屬于白介素-6(interleukin-6，IL-6)家族成員，是一種分泌型細胞因子。該因子與細胞因子受體樣因子1(cytokine receptor-like factor 1，CRLF1)或可溶性睫狀神經營養因子受體(soluble ciliary neurotrophic factor receptor，sCNTFR)相結合，并形成信號轉導復合物激活STAT3信號通路[3,4]。有研究在DGF中進行了篩選，發現CLCF1可能在DGF腎組織中表達上調。然而，CLCF1與DGF之間的關系尚不明確。本研究在腎移植術后并發DGF的患者中通過研究CLCF1的表達變化，分析該因子與DGF之間的關系，旨在為腎移植術后DGF的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者均來自于2016年1月至2019年1月在首都醫科大學附屬北京友誼醫院泌尿外科行腎移植手術的受者，均于術后24 h內采集靜脈血，立刻在3 000 r/min條件下離心5 min，分離血漿凍存于-80℃保存備用。術后每日監測血清肌酐變化。腎移植術后血清肌酐無顯著改善者為DGF組(n=10)。即刻移植腎功能恢復(immediate graft function，IGF)患者為IGF組(n=15)。2組患者年齡、性別比、體重，高血壓、糖尿病發病率，2組供者年齡、性別比、冷缺血時間、受者移植前血肌酐水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2 酶聯免疫吸附實驗 采用雙抗體夾心法人酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Cusabio，武漢)測定血漿中CLCF1表達。操作方法按照試劑商的說明進行。簡言之，將血漿樣品加到抗CLCF1抗體預包被的96孔板上，并在37℃下培養2 h。隨后棄去上清，加入生物素結合抗體替換上清液并在37℃下孵育1 h。隨后漂洗孔板，加入HRP標記的親和素，在37℃下孵育1 h。漂洗孔板5次后，加入TMB底物，并在37℃下反應1 h，然后加入終止液終止反應。采用酶標儀測定450 nm處光密度值，根據標準曲線計算CLCF1水平。

表1 2組基線資料比較

1.3 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件，數據采用中位數(四分位距)表示。采用Mann-Whitney U檢驗分析2組間的差異。以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者血清肌酐水平變化比較 DGF組患者血清肌酐無下降趨勢，而IGF患者血肌酐水平有較大降幅。見表2，圖1。

表2 2組腎移植受者術前及術后血清肌酐動態變化比較

圖1 IGF和DGF腎移植受者血肌酐變化表

2.2 2組血漿CLCF1表達水平在腎移植患者中上調 我們檢測了移植后24 h內所有腎移植受者血清CLCF1的變化。與IGF受者相比，DGF受者的血漿CLCF1顯著增加(2.53 ng/ml vs 1.01 ng/ml)。提示CLCF1與腎移植DGF有關。見圖2，表3。

2.3 血漿CLCF1水平與腎移植患者血肌酐下降水平之間的關系 術后第1到第5天血漿CLCF1水平與血肌酐下降值之間的關系，血肌酐負值越大提示腎功能恢復越好。結果可見，在術后第2、4、5天，血肌酐下

圖2 血漿CLCF1表達水平與腎移植DGF之間的關系

表3 25例腎移植受者術后24 h內血漿CLCF1水平比較 ng/ml,M(P25，P75)

降值(ΔCr)與CLCF1呈正相關(r值分別為0.444、0.447和0.639，P<0.05)，即CLCF1越大血肌酐下降幅度越小，腎功能恢復越差。由此提示，CLCF1是腎移植術后腎功能恢復的標志性分子。見圖3。

圖3 血漿CLCF1水平與血肌酐變化的相關性；縱軸為腎移植術后第1到第5天血肌酐與術前血肌酐的差值(單位：μmol/L)，橫軸為血漿CLCF1濃度，采用Spearman相關分析，相關系數ρ及P值如圖所示

3 討論

腎移植是終末期腎病最為有效的治療方法之一。我國每年等待腎移植治療的患者群體很大，而腎源相對不足的情況下導致了現階段的供需矛盾。供腎標準的擴大化是解決當前供需矛盾的有效策略。因此，維持移植腎的生存期對于節省醫療資料開支有至關重要的作用。但是由于多種原因，部分患者術后會產生DGF，嚴重影響腎移植治療效果。因此，找到與腎移植DGF相關的因子，對于該病的防治有至關重要的意義。本研究發現，CLCF1是一個新的DGF相關分子，其表達在DGF患者血漿中呈上調趨勢，這可能為腎移植術后DGF的防治提供有力的實驗證據。

DGF的發生可能與多種危險因素有關。其中，缺血再灌注損傷是可直接導致DGF的獨立危險因素。缺血再灌注損傷時可導致組織器官供氧不足，并通過促進糖酵解作用而引起細胞酸中毒[5]。缺血再灌注損傷還可誘導細胞死亡，并加重炎癥和氧化損傷[6]，而由于局部聚集的白細胞可黏附在微血管內，引起炎性反應[7]。這些變化增強了活性氧的釋放，從而促進炎性介質和蛋白水解酶的產生[8]，并最終導致DGF。

CLCF1是IL-6家族成員，廣泛表達于淋巴結、脾臟等次級淋巴器官及骨髓、卵巢、胎盤、腎臟、垂體等多種器官。CLCF1的分泌需要與CRLF1或sCNTFR相互作用以異源二聚體形式釋放[9]，并與細胞表面CNTFR結合，進而激活STAT3和ERK1/2/MAPK通路[9]。多種促炎因子，如TNF-α、INF-γ和IL-6等均可上調CRLF表達，并增強CLCF1的作用[10]。人類CLCF1或CRLF1基因突變導致CISS，而小鼠CLCF1的缺失則無法成活[11]。最近研究表明，CLCF1參與間充質干細胞向成骨細胞分化[21]以及巨噬細胞-泡沫細胞的轉化[12]。而在腎移植中，CLCF1可觸發腎移植后局灶節段性腎小球硬化的復發[13]。在本研究中，我們觀察到DGF腎移植受者的血漿CLCF1水平顯著上調，提示CLCF1可能在腎移植術后DGF中有重要作用，而該分子對腎移植DGF的具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，CLCF1是腎移植術后DGF中上調表達的分子，可能在腎移植DGF診斷及治療過程中有重要意義。